烟草诱导的中性粒细胞诱捕网对髓样树突状细胞的活化作用及红霉素干预的实验研究

摘要

文章主要从以下几部分进行论述： 第一部分 吸烟者与稳定期慢性阻塞性肺疾病患者痰中性粒细胞诱捕网和外周血髓样树突状细胞的表达及意义 目的：探讨吸烟者、稳定期慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者痰中性粒细胞诱捕网(NETs)和外周血髓样树突状细胞(mDCs)的表达及意义 方法：于2017年5月至2018年5月在广西医科大学第一附属医院门诊收集稳定期慢性阻塞性肺疾病患者32例的诱导痰和外周血。同期收集肺功能正常的吸烟者16例及肺功能正常的非吸烟者16例的诱导痰和外周血。采用免疫荧光法观察各组诱导痰NETs的形成。Picogreen荧光定量法检测各组诱导痰中NET-DNA的含量。流式细胞术检测各组外周血mDCs活化程度的表型特征和辅助性T淋巴细胞1(Th1)和辅助性T淋巴细胞17(Th17)的比例。采用Spearman相关分析对NETs水平与年龄、吸烟指数、体重指数、肺功能等进行相关性评价。最后对痰NET-DNA的水平和外周血mDCs表面共刺激分子CD40、CD86的表达，和辅助性T细胞中Th1和Th17的比例进行相关性分析。 结果：(1)与肺功能正常的吸烟者和肺功能正常非吸烟者相比，COPD患者诱导痰中的NET-DNA明显升高，结果具有统计学差异。但肺功能正常的吸烟者和非吸烟者相比，二者诱导痰中NET-DNA水平无统计学差异。(2)COPD患者外周血CD40+mDCs和CD86+mDCs和外周血Th1、Th17的比例均较肺功能正常的吸烟者和非吸烟者升高，结果均具有统计学差异。而肺功能正常者中的吸烟者与非吸烟者相比，外周血CD86+mDCs升高，结果具有统计学差异，但外周血CD40+mDCs和外周血Th1、Th17的比例无明显差异。(3)COPD患者痰NETs水平与FEV1/预计值呈负相关，与GOLD分级呈正相关，与年龄、吸烟指数、体重指数无关。(4)COPD患者痰NETs水平与外周血mDCs的CD40和外周血Th1细胞比例呈正相关，与CD86和Th17无明显相关性。 结论：COPD患者痰中的NETs水平显著增高并与气流受限程度相关，可作为评价COPD疾病严重程度的生物标志物之一。COPD患者树突状细胞活化和Th1细胞反应可能与痰NETs的升高有关。吸烟状态下气道中NETs的量可能反映了个体对COPD疾病的易感性。 第二部分 烟雾提取物诱导的NETs活化树突状细胞并影响Th1和Th17分化的细胞实验 目的：探讨烟草烟雾提取物(CSE)诱导的中性粒细胞诱捕网(NETs)对髓样树突状细胞活化作用，观察NETs通过树突状细胞对Th1和Th17分化的影响。 方法：使用淋巴细胞分离液分离健康者静脉血中的PBMCs，用贴壁法得到单核细胞，用1000U/ml GM-CSF和500U/ml IL-4诱导6天得到人单核来源的树突状细胞(MoDCs)。用Histopaque1119+Percoll法分离COPD患者血中的中性粒细胞。用CSE诱导中性粒细胞生成NETs，并用AluI酶切法分离NETs。用以上分离提取的NETs刺激MoDCs并继续培养15小时，流式细胞术检测NETs刺激结束后MoDCs上共刺激分子CD40、CD86和HLA-DR的表达情况，并与未经NETs刺激的MoDCs的以上指标进行对比;ELISA检测各组MoDCs上清中的IL-1β、IL-12、和TNF-α浓度。免疫磁珠法分离健康者PBMCs中的初始CD4+T淋巴细胞，与经NETs刺激的MoDCs进行共培养4天。流式细胞术检测共培养后初始CD4+T淋巴细胞的分化成Th1和Th17的比例。 结果：(1)经过CSE诱导的NETs刺激的MoDCs表面共刺激分子CD40、CD86和HLA-DR均较未予NETs刺激的MoDCs升高，差异均具有统计学意义。(2)经过CSE诱导的NETs刺激的MoDCs上清中IL-1β、IL-12、和TNF-α的浓度均较单纯MoDCs培养孔上清中的含量明显升高，差异均具有统计学意义。(3)初始CD4+T淋巴细胞与MoDCs共培养4天，与对照组相比，经NETs刺激的MoDCs与初始CD4+T淋巴细胞共培养产生Th1和Th17的比例增多，结果具有统计学意义。 结论：CSE诱导的NETs可促进MoDCs产生IL-1β、IL-12、和TNF-α，并促进MoDCs的成熟和活化。经过NETs活化后的MoDCs可促进初始CD4+T淋巴细胞向Th1和Th17分化。 第三部分 红霉素抑制烟草烟雾提取物诱导中性粒细胞诱捕网生成的作用和机制探讨 目的：探讨红霉素抑制烟草烟雾提取物(CSE)诱导的中性粒细胞诱捕网(NETs)的作用和可能机制。 方法：抽取10例稳定期慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者静脉血，用Histopaque1119+Percoll法分离提纯外周血中性粒细胞。用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)抑制剂二亚苯基碘(DPI)或红霉素（终浓度10μg/ml）对中性粒细胞进行预孵育30min处理，随后加入CSE刺激4小时诱导NETs生成。实验中设置CSE单纯刺激孔、CSE+红霉素干预孔、CSE+DPI干预孔、单纯红霉素孔、单纯DPI孔和培养基空白对照孔。荧光法观察各孔中性粒细胞NETs形成。用Picogreen法观察各孔细胞上清NET-DNA的水平，用蛋白酶底物显色法及ELISA检测各组中NETs相关的中性粒弹性蛋白酶(NE)和髓过氧化物酶(MPO)的浓度。另外抽取6例COPD患者静脉血，相同方法分离中性粒细胞。向中性粒细胞加入DPI或红霉素（终浓度10μg/ml）进行预孵育30min处理，加入CSE刺激1小时后收取中性粒细胞进行2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)标记30min，随后用流式细胞术检测各组中性粒细胞DCFH-DA的平均荧光强度(MFI)，即代表胞内活性氧(ROS)水平。 结果：(1)与培养基空白对照相比，CSE单纯刺激孔产生更多的NET-DNA，同时NETs相关的NE和MPO的浓度更高，结果具有统计学意义。(2)CSE+DPI干预孔的NET-DNA较CSE单纯刺激孔的NET-DNA减少，结果具有统计学意义，提示DPI可以抑制CSE刺激诱导的NETs。(3)CSE+红霉素干预孔的NET-DNA较CSE单纯刺激孔的NET-DNA减少，同时CSE+红霉素干预孔的NETs相关NE和MPO的浓度较CSE单纯刺激孔减少，结果均具有统计学意义。(4)CSE+DPI干预孔的中性粒细胞的DCFH-DA的MFI较CSE单纯刺激孔的MFI减低;CSE+红霉素干预孔的中性粒细胞的MFI也较CSE单纯刺激孔的MFI减低，结果均具有统计学意义，提示DPI及红霉素均可以抑制CSE刺激诱导中性粒细胞产生ROS。 结论：CSE刺激下产生NADPH依赖的活性氧(ROS)反应可能是烟草烟雾暴露诱导NETs生成的机制之一。红霉素可能通过抑制中性粒细胞的NADPH氧化酶依赖的ROS反应从而减少NETs的产生。红霉素亦可能通过抑制NE和MPO减少NETs形成。 第四部分 红霉素抑制小鼠体内中性粒细胞诱捕网及树突状细胞活化对烟草相关肺部炎症的影响 目的：探讨红霉素抑制小鼠体内中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)及树突状细胞活化及对烟草相关肺部炎症的影响。 方法：领取30只野生型雄性C57BL/6J小鼠（鼠龄6-8周），由广西医科大学动物实验中心提供。用随机数字表法将30只小鼠分为烟草烟雾暴露组(CS)、烟草烟雾暴露下红霉素干预组(EM)和空气暴露对照组(Air)。CS组和EM组给予烟草烟雾暴露24周。其中，EM组从第12周末开始给予红霉素(100mg/kg/d)灌胃处理，至24周结束。Air组给予空气伪暴露24周。第24周末，将各组小鼠处死。留取各组肺泡灌洗液(BALF)，用Picogreen法检测各组BALF中的NET-DNA水平，并用ELISA方法检测BALF中NETs相关成分NE、MPO、组蛋白3和瓜氨酸化的组蛋白3(CITH3)的浓度。各组小鼠左肺上叶经固定、包埋、切片后行病理HE染色并计算平均内衬间隔(MLI)。各组小鼠的脾脏和肺脏制备单细胞悬液并用流式细胞术检测肺髓样树突状细胞(mDCs)上CD40和CD86的表达，以及脾肺中Th1、Th17比例。 结果：(1)与Air组相比，CS组小鼠BALF中的NETs水平、游离NE、MPO、Histone3和CITH3及中性粒细胞比例明显升高，结果均具有统计学差异;与CS组相比，EM组小鼠BALF中的NETs水平、游离NE、MPO和Histone3和中性粒细胞比例明显降低，结果均具有统计学差异。(2)与Air组相比，CS组小鼠肺部mDCs的共刺激分子CD40和CD86升高，肺部和脾脏Th1和Th17比例升高;与CS组相比，EM组小鼠肺部mDCs的共刺激分子CD40和CD86降低，肺部和脾脏Th1和Th17比例降低，结果均具有统计学差异。(3)CS组的MLI较Air组升高，而EM组的MLI较CS组降低，结果均具有统计学差异。相关性分析结果提示MLI与NETs水平、mDCs上CD40和CD86的表达、Th1和Th17比例均呈正相关，结果具有统计学意义。 结论：烟草暴露下小鼠气道内的NETs水平与树突状细胞的活化和Th1和Th17细胞反应成正相关。红霉素干预可减少小鼠气道内NETs，同时减轻获得性免疫反应。红霉素可能通过减少NETs的产生从而对树突状细胞活化产生一定负向调控作用从而减轻烟草相关肺部炎症。