HIV--1感染长期不进展者全转录组测序分析以及关键天然免疫通路激活水平研究

摘要

目的: HIV-1感染长期不进展者(Long term non-progressors，LTNPs)是能天然控制HIV、维持宿主良好免疫的一类特殊人群，其机制与病毒、宿主遗传特征、免疫应答等多种因素有关，但天然免疫激活水平与长期不进展的关系尚未明确。本研究基于全转录组测序展示HIV-1感染长期不进展者和典型进展者的mRNA和非编码RNA表达谱，通过功能富集分析和ceRNA调控网络分析，从全转录水平分析mRNA和编码RNA在HIV-1感染长期不进展中的作用，并基于测序结果，在人群水平深入探讨关键天然免疫信号通路的激活水平与HIV-1感染长期不进展的关系。 方法: 1.转录组测序及差异表达分析:选取3例HIV-1感染长期不进展者和3例典型进展者，采集静脉血，分离PBMC并提取总RNA，构建cDNA文库并进行高通量测序。经过数据过滤和注释，获得mRNA、lncRNA、small RNA和circRNA的表达量并进行差异表达分析。 2.功能富集分析:对差异表达的mRNA进行PPI互作网络分析、GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。对差异表达lncRNA、small RNA和circRNA进行靶基因预测，对靶基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。 3.ceRNA网络构建:根据靶基因预测结果，对具有靶向关系的差异lncRNA、miRNA、mRNA进行共表达分析，表达量呈负相关的miRNA-mRNA对、miRNA-lncRNA对，经过超几何分布检验筛选lncRNA-miRNA-mRNA互作关系，构建lncRNA-miRNA-mRNA互作网络。以同样的方法构建circRNA-miRNA-mRNA互作网络。 4.NOD样受体信号通路激活水平检测:招募HIV-1感染长期不进展者（LTNPs组）、典型进展者（TPs组）、抗病毒治疗患者（ART组）和健康对照者（HC组），采集静脉血，分离PBMC。使用PCR检测NOD样受体信号通路中NLRP3、IL-1β和caspase-1的mRNA表达水平，采用流式细胞术检测各组人群caspase-1即细胞焦亡发生水平，ELISA检测血浆中caspase-1、IL-1β含量。 5.胞内DNA识别信号通路激活水平检测:PCR检测NOD样受体信号通路cGAS、IFI16等因子的mRNA表达，Western Blot检测IFI16、STING蛋白表达水平。 结果: 1.差异表达mRNA及其功能:与典型进展者相比，长期不进展者中差异表达的mRNA有543个，其中上调的mRNA205个，下调338个。GO富集显示差异表达mRNA主要富集在胞内过程、细胞组分、催化活性等二级GO条目。KEGG富集分析显示，差异表达mRNA主要富集在胞内DNA识别通路、NOD样受体信号通路和TNF信号通路等天然免疫相关信号通路。 2.差异表达lncRNA及功能:共发现1297个差异表达lncRNA，长期不进展者中上调的lncRNA1108个，下调的lncRNA189个，其中负调控宿主抗病毒应答的lncRNA-NRAV在LTNP组表达下调。 3.差异表达small RNA、circRNA及其功能:两组间差异表达的small RNA有45个，已有功能报道的miRNA有8个。两组间差异表达的circRNA155个，均为本次研究新预测的circRNA，其中circRNA090的来源基因为NLRP3。 4.lncRNA-miRNA-mRNA互作网络包含14个miRNA、16个lncRNA和64个mRNA构成的100对互作关系，circRNA-miRNA-mRNA包含17个miRNA、34个circRNA和71个mRNA构成的142对互作关系。T细胞专向分化相关的转录因子TCF7均处于以上两个互作网络中。 5.NOD样受体信号通路激活水平:LTNPs组、TPs组、ART组和HC组四组人群NOD信号通路中NLRP3的mRNA表达量分别为4.14±3.76、1.90±1.57、2.60±2.73、1.33±1.23，差异具有统计学意义(F=3.202，P=0.030)，LTNPs组表达量高于TPs组(t=2.542，P=0.015)。在NLRP3诱导的细胞焦亡发生水平方面，四组人群外周血PBMC发生焦亡的水平均较低，caspase-1阳性细胞比例差异无统计学意义(F=0.529，P=0.672)。同样，血浆的caspase-1含量也未在各组发现统计学差异(F=0.852，P=0.475)。在通路下游炎症因子方面，四组人群IL-1β的mRNA表达量和蛋白表达量差异均无统计学意义(P＞0.05)。 6.胞内DNA识别信号通路激活水平:四组人群胞内DNA识别信号通路中，模式识别受体cGAS和IFI16的mRNA表达水平在各组间的差异均有统计学意义(P＜0.01)，并且LTNPs组均低于TPs组(P＜0.01);通路关键中间因子STING和TBK1的mRNA表达水平呈现同样的趋势，LTNPs组均低于低于TPs组(P=0.024);进一步在蛋白水平发现，LTNPs组和TPs组IFI16蛋白相对表达量分别为0.19±0.08、0.54±0.19，LTNPs组低于TPs组，差异有统计学意义(t=2.908，P=0.044);而STING在LTNPs组和TPs组的蛋白相对表达也存在显著差异(t=3.015，P=0.039)，平均值分别为1.85±0.73、3.37±0.47，LTNP组低于TP组。 结论: 1.HIV感染长期不进展人群和典型进展人群的mRNA、lncRNA、miRNA和circRNA表达谱存在较大的差异，富集到多条天然免疫通路可能与HIV长期不进展相关，而非编码RNA可能通过ceRNA机制调控天然免疫通路中关键因子mRNA的表达。 2.在HIV感染长期不进展者人群中，未发现NOD样受体信号通路的激活，但胞内DNA识别信号通路的cGAS/IFI16-STING的激活水平明显被抑制，这可能是该人群的疾病不进展的原因之一。