利用肝癌外泌体发现lnc85标志物及传递Cu--Cy纳米光敏剂的研究

摘要

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球范围内的恶性肿瘤之一。在中国具有相对较高的发病率和病死率，2015年HCC新发病例和死亡病例数分别为466，100和422，100例。临床上，由于缺乏特异性的生物标志物和明显的临床症状，大多数HCC患者在被确诊时已处于肝癌晚期，超过80％的患者出现预后不良。另外由于肝癌的复发和转移，目前应用于临床的治疗方法都存在一定的局限性，且治疗效果难以尽如人意。因此，研究与HCC发病和发展有关的分子机制从而发现新的治疗靶点，同时研发新的有效的治疗手段迫在眉睫。 外泌体是由多种类型细胞分泌，粒径在30～150nm之间的囊泡样小体。由于外泌体与其供体细胞间的特异性亲和性，及其天然的生物相容性，是治疗性药物递送的理想载体。目前，已有研究者成功运用外泌体作为癌症化疗药物的载体进行肿瘤的靶向治疗。除运载传统化学药物外，外泌体还可作为一些新型药物的载体。铜胺纳米材料(Copper-cysteamine，Cu-Cy NPs)是一种新型的光敏剂，它在紫外光、X射线及微波的激发下可以产生红光，是实现光动力疗法（Photodynamic therapy,PDT）的主要因素之一。PDT由于低毒、低创、易操作及良好的重现性，成为传统手术和化疗理想的替代方式。PDT主要通过由光激活的光敏剂与组织细胞中存在的氧分子发生反应，产生细胞毒性的活性氧继而引发目标细胞的凋亡而达到治疗目的。目前Cu-Cy NPs的PDT应用仍然处于研究的早期阶段，其生物毒性、光动力反应性以及生物递送途径还未得到充分的评估。 本研究包括两部分内容:第一部分，利用肝癌外泌体发现lnc85标志物及相关作用机制研究;第二部分，Cu-Cy新型纳米光敏剂的抗肝癌及外泌体传递效应的研究。在第一部分，主要对HCC循环外泌体中lncRNA的表达特征进行描述，探索其参与HCC发生、发展的分子机制，并评估其作为HCC血清生物标志物的潜在价值;第二部分，通过体内试验和体外试验探讨Cu-Cy NPs在HCC的光动力学治疗中应用的可能性，并探索外泌体作为Cu-Cy NPs运送载体的可能。本文主要分为以下几个部分: 第一部分:利用肝癌外泌体发现lnc85标志物及相关作用机制研究 目的: 探索循环外泌体中的lncRNA的表达特征，探索lncRNA参与HCC发生发展的分子机制，并评估其作为HCC血清生物标志物的潜在价值。 方法: 1.外泌体抽提试剂盒提取4例肝细胞癌患者和6例健康对照者血浆中的外泌体，并通过RNA全转录本测序检测两组血浆外泌体中差异表达的lncRNA和mRNA。 2.与包含有34种细胞基因转录本信息的开放数据库进行对比，综合描述HCC患者血浆外泌体中lncRNA和mRNA的相对表达特征。 3.超高速离心法提取HepG2和Huh7细胞培养上清中的外泌体并采用Nanosight、TEM和Western blot进行验证。 4.选取血浆外泌体中差异表达量显著升高的lncRNA进行细胞和细胞外泌体的qRT-PCR验证，确定候选差异表达lncRNA。 5.针对候选lncRNA设计siRNA，通过siRNA转染HL-7702，HepG2和Huh7细胞，采用CCK-8试剂盒、Transwell试验和流式细胞术检测候选lncRNA对细胞增殖、迁移、以及凋亡的影响，选择对肝癌细胞行为学影响明显的RP11-85G21.1(lnc85)做进一步研究。 6.通过Ensembl、LNCipedia version和lncLocator数据库查询lnc85的基因组定位、具体序列信息、序列长度、亚细胞定位等基本信息;并通过靶基因预测网站RegRNA预测lnc85的靶向microRNA。 7.qRT-PCR检测lnc85抑制前后HL-7702，HepG2和Huh7细胞中lnc85与mir-324-5p的表达量，探索其表达的相关关系;并通过Western blot检测lnc85抑制后Huh7细胞中mir-324-5p下游基因表达的情况。 8.qRT-PCR检测112例肝细胞癌患者及52例健康对照者血清中lnc85的表达，探讨lnc85作为HCC血清生物标志物的潜能。 结果: 1.A有9，440条，其中有8，963条上调，477条下调。 2.HCC患者血浆外泌体中lncRNA与mRNA的相对表达特征分析:HCC血浆外泌体中，相对于mRNA，lncRNA具有更高的表达水平(lncRNA vs.mRNA=4.13vs.2.21，P＜0.01)，更高的表达特异度(lncRNA vs.mRNA=25.48％vs.18.99％)，较低的剪接效率（lncRNA vs.mRNA=0.38vs.0.53，P＜0.01），以及较低的个体变异度(lncRNA vs.mRNA=0.4vs.0.68，P＜0.01)。 3.HepG2和Huh7细胞培养上清外泌体的验证:Nanosight结果显示80％以上的颗粒粒径在30～150nm之间，峰值为59nm，符合外泌体的粒径范围;TEM结果展现了外泌体典型的双层膜囊泡样结构;Western blot检测到三种已知的外泌体生物标志物(Alix，HSP70和CD9);经三种验证方法确认细胞培养上清的提取物为细胞外泌体。 4.qRT-PCR验证候选差异表达lncRNA:按照Fold Change≥6且P值≤0.05的标准从RNA测序结果中筛选出6条表达上调最明显的lncRNA，分别为lnc544、lnc380、lnc239、lnc959、lnc171和lnc85;qRT-PCR检测结果显示，6条候选差异表达lncRNA中，除lnc380外，其余5条候选差异表达lncRNA均在肝癌细胞及其分泌的外泌体中表达显著升高（P＜0.01），与测序结果一致。 5.探讨5条候选lncRNA对细胞增殖、凋亡、以及迁移的影响: 6.lnc85的基本信息查询及靶向microRNA的预测结果显示:lnc85定位于1号染色体的157232231-157237136位上，其基因前后10kb内无任何可编码蛋白的序列;lnc85转录本序列长度为399bp，其成熟体具有2个外显子;lnc85主要定位于细胞质中(score:0.60);其靶向的microRNA为mir-324-5p。 7.lnc85与mir-324-5p表达的相关性及机制研究 8.lnc85作为HCC血清生物标志物的潜能:HCC患者血清中lnc85的表达量明显高于健康对照者(P＜0.01);并且lnc85在AFP阴性的HCC患者血清中的表达水平也显著高于健康对照者;ROC曲线分析结果显示，在区分健康对照者与HCC患者时，lnc85的曲线下面积(AUC)为0.861，当截断值(cut off)为1.514时，lnc85诊断HCC的灵敏度和特异度分别为80.9％和74.5％;而在区分健康对照者与AFP阴性患者时，其AUC为0.872，当cut off为1.692时，lnc85诊断的灵敏度和特异度分别为80.5％和76.4％。 结论: 1.HCC患者血浆外泌体中，相对于mRNA，lncRNA具有更高的表达水平、更高的表达特异性、较低的剪接效率和个体变异度。 2.HCC患者血浆循环外泌体中的差异表达lncRNA可能调控细胞的增殖、凋亡或迁移活动。 3.lnc85通过抑制mir-324-5p的表达调节其下游基因，从而调控肝癌细胞的增殖。 4.lnc85具有作为HCC血清标志物的潜能，可与其他标志物联合提高肝癌诊断的灵敏度。 第二部分:Cu-Cy新型纳米光敏剂抗肝癌作用及外泌体传递效应的研究 目的: 探讨由新型铜胺纳米材料(Cu-Cy NPs)介导的光动力学技术在体内外环境中对肝细胞癌的作用，以及利用肝癌细胞外泌体传递Cu-Cy NPs的效应研究。 方法: 1.Cu-Cy NPs抗肝癌研究 2.利用肝细胞外泌体传递Cu-Cy NPs的效应研究 结果: 1.Cu-Cy NPs抗肝癌研究 2.利用肝细胞外泌体传递Cu-Cy NPs的效应研究 结论: 1.Cu-Cy NPs可被紫外光激活，从而产生1O2。 2.Cu-Cy NPs与紫外光结合可显著降低HepG2细胞的细胞活性，并由Cu-Cy NPs产生的单线态氧通过诱导细胞凋亡从而杀死癌细胞，抑制动物体内肿瘤的生长。 3.Cu-Cy NPs可以被包裹于肿瘤细胞分泌的外泌体，外泌体可以作为Cu-Cy NPs在肿瘤组织细胞靶向运输的载体。