消旋-3-正丁基苯酞对Cuprizone诱导的急性脱髓鞘小鼠模型的作用及机制研究

摘要

多发性硬化(Multiple sclerosis，MS)是一种以中枢神经系统白质炎性脱髓鞘为特征的自身免疫性疾病，目前对MS治疗的主要机制是抑制急性期炎性脱髓鞘病变进展，并非直接促进髓鞘修复，大部分的药物都是作用于免疫系统，通过免疫抑制或免疫调节起作用。越来越多的观点认为，促进髓鞘再生诱导修复和增强神经保护作用可以作为MS免疫调节治疗的补充，这可以更好的促进疾病的自然修复。消旋-3-正丁基苯酞(DL-3-n-butylphthalide，NBP)是一种人工合成的消旋体，被证实能通过改善线粒体功能从而影响神经细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞的生长和凋亡，但是该药对少突胶质细胞和脱髓鞘的作用尚不明确。前期我们研究显示NBP可以改善脱髓鞘患者的症状及减轻脑磁共振的白质脱髓鞘病灶，并且在溴化乙锭脱髓鞘大鼠模型中显示出抗细胞凋亡作用，但机制尚不明确。双环己酮草酰二腙(Cuprizone，CPZ)脱髓鞘小鼠模型是MS研究常用的动物模型，其以损伤线粒体功能导致少突胶质细胞凋亡为特征，由于CPZ喂养可诱导小鼠可逆性脱髓鞘，更适合用于髓鞘脱失和再生机制的研究。因此，本研究拟在此基础上，构建CPZ脱髓鞘小鼠模型，采用NBP进行治疗，探索其治疗的效果和可能作用机制，为临床治疗MS提供新的候选药物。 第一部分CPZ脱髓鞘小鼠模型建立和NBP对脱髓鞘模型的行为学和髓鞘的影响 目的:构建CPZ脱髓鞘小鼠模型，研究NBP对脱髓鞘小鼠的行为学影响和观察NBP治疗后髓鞘和轴突的变化。 方法:取6-7周龄C57BL/6雄性小鼠，体重在15-16g之间，按不同实验目的分为模型建立部分和药物行为学观察和机制研究部分:(1)模型建立部分:分为正常组3只，CPZ模型组15只，共18只。正常组每天喂养普通饲料，CPZ模型组每天喂养含有0.2％CPZ的混合鼠粮;CPZ模型鼠从喂养鼠粮开始每隔一周心脏灌注取材，从第1周末开始，每周3只灌注取材，连续5周，第5周末结束（分别为CPZ1周组，CPZ2周组，CPZ3周组，CPZ4周组，CPZ5周组）;(2)NBP药物行为学观察和机制研究部分:分别为对照组，CPZ模型组，10mg/kg NBP+CPZ治疗组，20mg/kg NBP+CPZ治疗组，每组10只，共40只。对照组每天喂养普通饲料，模型组和治疗组每天喂养含有0.2％CPZ的混合饲料，在第2周开始各浓度NBP组每天按小鼠体重腹腔注射NBP1次，对照组和CPZ模型组腹腔注射0.9％生理盐水0.1毫升，于每周末称量体重变化直至第5周末，各组均在第5周末取材。 结果:1.与对照组相比，随着时间延长，同期CPZ模型小鼠体重明显下降（P＜0.05），NBP腹腔注射4周后能够缓解CPZ小鼠体重的下降(P1＜0.01，P2＜0.01)。2.旋转棒实验发现第5周CPZ模型小鼠在转棒上停留的时间明显减少，平衡功能明显落后于对照组小鼠（P＜0.05）。而与模型组比较，两种不同浓度的NBP组均可以增加小鼠在转棒上停留的时间(P1＜0.05，P2＜0.05)。旷场实验研究发现，4个组小鼠的移动速度和总路程均无明显差异（P＞0.05）。水迷宫实验研究表明，前5日各组小鼠逃避潜伏期均逐日下降，但在第6日4个组小鼠在目标象限累计距离和穿越平台次数均无明显差异（P＞0.05）。3.LFB髓鞘染色与对照组比较，CPZ模型小鼠胼胝体在第2周时开始出现髓鞘脱失(P＜0.05)，在第4周时髓鞘脱失更加显著，第5周时髓鞘脱失基本完毕(P＜0.05)，形成急性脱髓鞘模型。第5周末与CPZ模型组比较，两种浓度NBP治疗组均可改善CPZ模型小鼠胼胝体脱髓鞘程度并与药物浓度存在关联性（P1＜0.001，P2＜0.001），高浓度NBP比低浓度NBP更有效减轻脱髓鞘(P＜0.001)。4.电镜结果提示CPZ模型小鼠胼胝体存在髓鞘超微结构破坏和轴突线粒体损伤，NBP治疗后可以促进髓鞘板层结构完整性，保护轴突线粒体。 结论:1.CPZ模型小鼠出现体重下降和平衡功能障碍，而NBP能够改善CPZ脱髓鞘小鼠的体重和平衡障碍。2.CPZ模型小鼠的髓鞘随时间延长逐渐脱失，第5周时髓鞘完全脱失，NBP治疗后可改善脱髓鞘并与浓度有相关性。3.高浓度的NBP通过促进髓磷脂蛋白质PLP和MBP的生成从而减轻CPZ模型小鼠中的髓鞘脱失。4.CPZ脱髓鞘小鼠存在轴突及线粒体损伤，NBP可以保护线粒体结构完整性，减轻轴突损伤。 第二部分NBP抑制NF-κB信号通路活化减轻炎症反应 目的:采用CPZ脱髓鞘小鼠模型，研究CPZ模型小鼠炎症细胞浸润变化及NBP对脱髓鞘小鼠的炎症浸润影响，并进一步探讨NBP对NF-κB信号通路活化的影响。 方法:实验动物和分组同第一部分。采用HE染色和GFAP、Ibal-1免疫组织化学染色标记并观察各组胼胝体区域炎性细胞浸润、星形胶质细胞和小胶质细胞的变化，WB检测各组NF-κB(p65)、IκBα、TNF-α蛋白的表达水平。 结果:1.与对照组比较，CPZ脱髓鞘小鼠胼胝体随着时间延长炎性细胞浸润逐渐加重，在第4、5周时炎性浸润明显达到高峰(P＜0.05)，第5周时CPZ组星形胶质细胞和小胶质细胞明显增生活化(分别为P＜0.001和P＜0.001)。2.与CPZ模型组比较，NBP治疗4周后能够减轻小鼠胼胝体炎性细胞浸润程度(P1＜0.001，P2＜0.001)，同时能够抑制星形胶质细胞异常增生（P1＜0.001，P2＜0.001）和小胶质细胞的活化(P1＜0.001，P2＜0.001)并与药物浓度存在关联性，高浓度NBP抑制效果较低浓度NBP更显著(P＜0.01)。3.与对照组比较，CPZ模型组促进了胼胝体IκBα降解(P＜0.001)、NF-κB(p65)核易位（P＜0.001）以及促炎症细胞因子TNF-α的释放(P＜0.01)。NBP治疗后均可抑制NF-κB(p65)核移位(P1＜0.05，P2＜0.001)，减轻IκBα的降解(P1＜0.05，P2＜0.001)，降低CPZ小鼠中的TNF-α水平(P1＜0.05，P2＜0.01)，但是高浓度的NBP的抑制效果较低浓度的NBP更显著（P＜0.05）。 结论:1.CPZ模型小鼠的炎性细胞浸润随时间延长逐渐增加，NBP治疗后可减轻炎性细胞浸润并抑制模型组中星形胶质细胞和小胶质细胞增生活化。2.NBP通过抑制NF-κB信号通路活化和TNF-α的表达从而抑制炎症反应。 第三部分NBP抑制线粒体凋亡信号通路保护少突胶质细胞 目的:采用CPZ脱髓鞘小鼠模型，研究CPZ模型小鼠少突胶质细胞(Oligodendrocyte，OL)和少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte precursor cell，OPC)变化及NBP对脱髓鞘小鼠少突胶质细胞谱系的影响。 方法:实验动物和分组同第一部分。采用CC1、NG2、Olig2免疫组织化学染色标记并观察各组OL和OPC的变化，Tunel+CC1免疫荧光染色检测各组OL凋亡情况，WB检测线粒体途径相关凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Cyt C、Cleaved Caspase-3水平。 结果:1.与对照组相比，CPZ模型组胼胝体CC1标记的OL从第2周开始数量逐渐减少(P＜0.05)，在第4周达最低值（P＜0.05），之后在第5周末OL数量明显增多(P＜0.05)。同时，胼胝体NG2标记的OPC从第2周开始增多，第5周末数量则达到高峰。2.在第5周末，NBP组OL数量相比模型组明显减少（P1＜0.001，P2＜0.001）。模型组第三脑室室管膜下区存在OL凋亡，与模型组相比，高浓度的NBP组通过降低Bax/Bcl-2（P＜0.01）、Cyt C(P＜0.01)、Cleaved Caspase-3(P＜0.05)蛋白表达减少OL的凋亡(P＜0.05)。3.在第5周时CPZ组胼胝体OPC数量较对照组明显增加(P＜0.001)，与CPZ组比较，NBP组OPC数量显著下降（P1＜0.001，P2＜0.001）。另外模型组Olig2阳性表达较对照组表达明显增多（P＜0.01），NBP组Olig2表达相比模型组显著减少（P1＜0.01，P2＜0.001）。 结论:1.在喂养CPZ鼠粮2-4周，CPZ模型组胼胝体存在OL的丢失及OPC增殖和迁移，而在第5周末OPC增殖达到高峰并分化为成熟的OL。2.喂养CPZ鼠粮5周仍有OL凋亡，而高浓度的NBP通过抑制Bax/Bcl-2、CytC和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平减轻OL凋亡。 全文结论: 本研究采用CPZ脱髓鞘小鼠模型、通过行为学测试结合各种分子生物学研究方法，探讨NBP在脱髓鞘疾病中的治疗作用和可能作用机制，开发NBP新的用途。研究结果显示:1.NBP可以减轻CPZ脱髓鞘小鼠的髓鞘脱失和轴突损伤;2.NBP通过抑制NF-κB信号通路活化减轻炎症反应;3.NBP抑制线粒体凋亡信号通路的启动从而保护OL。 NBP在脱髓鞘疾病中通过抗炎和增强神经保护作用促进髓鞘的修复。