重组人成纤维细胞生长因子8a生产工艺及药效学初探

摘要

成纤维细胞生长因子8a (fibroblast growth factor 8,FGF8)作为成纤维细胞生长因子家族(fibroblast growth factor family,FGFs家族)的第8个成员的a亚型,它具有一般家族成员的作用：促进软骨形成、活化上皮细胞、促进伤口愈合等,同该家族的其他成员相比,FGF8a有望成为既刺激正常细胞分化,又无诱导癌变之虞的新一代细胞生长因子。FGF8a用药的有效性和安全性成为全球研究的焦点。本研究首先在摇瓶实验中摸索发酵基本条件,从培养基pH值、诱导时机、IPTG诱导终浓度和诱导温度四个影响因素做“四因素四水平”正交实验设计,找出最适发酵工艺参数。然后根据摇瓶实验结果和以往经验控制发酵参数,进行发酵罐发酵。发酵结束后离心收菌,进行SDS-PAGE分析目的蛋白含量。纯化过程中对前期的方法进行优化,简化蛋白复性操作。然后采用MTT法检测rhFGF8a蛋白活性,计算出蛋白生物学活性。在药效学方面,首先进行鸡胚尿囊膜(CAM)实验,观察rhFGF8a在诱发CAM血管生成的能力；然后研究rhFGF8a与间隙连接蛋白抑癌基因Cx43的关系,通过western blotting印迹分析观察rhFGF8a能否独立上调Hela细胞Cx43蛋白的表达。研究表明,摇瓶正交实验得出最优参数组合为培养基pH值7.0,IPTG诱导时机OD600值为0.5, IPTG终浓度为0.5mM、诱导温度30℃。在发酵过程中,参数控制为：(1)空气流量初始设定为10L/min,诱导后升为15L/min,溶氧控制在40%；(2)温度初始为37℃,诱导时降到30℃；(3)pH值设定为7.0；(4)搅拌速度：设定搅拌速度下限为105rpm,上限为500 rpm；(5)补料：在发酵培养基中培养3h后开始匀速补料250ml/h。发酵结束收获菌体20g/L,经SDS-PAGE电泳分析目的蛋白rhFGF8a表达量占菌体总蛋白的30%左右。优化蛋白纯化条件,蛋白复性所需的氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽用量减少至原来的1/10,尿素浓度从4M梯度开始,降低了成本,rhFGF8a纯化过程蛋白收率为57%。MTT法检测结果表明发酵纯化后收集的蛋白对成纤维3T3细胞有一定的促增长作用,生物学活性为22000IU/mg。药效学方面,CAM实验表明,rhFGF8a较bFGF在诱发CAM血管生成能力上相对较弱；Western blotting印迹表明rhFGF8a能独立上调Hela细胞抑癌基因Cx43的表达。

目录

摘要

ABSTRACT

第1章 前言

1 成纤维成纤维细胞生长因子家族的研究概况

2 成纤维细胞生长因子8 的研究概况

3 RHFGF8A 较其他细胞生长因子的优越性

4 抑癌基因CX43 的概述

5 发酵工程概述及其影响因素

6 本课题的意义与主要内容

第2章 实验仪器和材料

1 主要仪器

2 实验材料

第3章 实验方法

1 RHFGF8A 的发酵纯化工艺流程图

2 RHFGF8A 的发酵培养过程

3 RHFGF8A 蛋白纯化方法的优化

4 RHFGF8A 生物学活性检测方法（细胞增殖法/MTT 比色法）

5 RHFGF8A 与鸡胚新生血管生成能力的研究

6 RHFGF8A 上调HELA 细胞抑癌基因表达的试验研究

第4章 结果与分析

1 RHFGF8A 的发酵培养结果

2 纯化方法的优化结果

3 RHFGF8A 生物学活性检测分析

4 RHFGF8A 蛋白对CAM 血管生成的分析

5 RHFGF8A 上调HELA 细胞抑癌基因表达的WESTERN BLOTTING 分析

第5章 分析与讨论

1 关于发酵过程中影响RHFGF8A 蛋白表达量的因素的探讨

2 探讨RHFGF8A 蛋白纯化方法的优化

3 RHFGF8A 蛋白对血管生成的动物模型的选择

4 有关RHFGF8A 上调抑癌基因表达的研究

第6章 小结与展望

参考文献

附录一 RHFGF8A 基因序列

附录二 RHFGF8A 蛋白序列

致谢