四种药用野生蕨类植物的组织培养研究

摘要

药用蕨类植物一直作为传统中药被沿用至今。随着新技术新方法在植物药用成分分离分析上的应用,越来越多蕨类植物所含的药用成分被发现,人们对药用蕨类植物的需求也正愈来增加。由于被肆意开采、其生态环境正被严重破坏,许多野生药用蕨类植物种类面临灭绝的厄运,更满足不了中药材市场的需求。组织培养为野生药用蕨类植物基础研究、保护和开发利用提供必要的手段。本文从4种药用凤尾蕨属(Pteris L.)植物的成熟孢子组织培养开始,利用组织培养技术、显微摄像、制片技术等实验手段,研究其配子体(Gametophyte,G)发育、配子体增殖和配子体愈伤组织及孢子体诱导等；其中大半边旗(Pteris dissitifolia Bak.)和傅氏凤尾蕨(Pteris fauriei Hieron.)配子体在不含植物激素培养基中形成的愈伤组织诱导胚状体(Embryoid,E)形态发生的组织细胞学观察,是国内首次对蕨类植物胚状体进行的研究。主要结论如下：(1)大半边旗(Pteris dissitifolia Bak.)大半边旗成熟孢子在1/2 MS和1/2 MS大量元素两种固体培养基中都能萌发并最终形成孢子体。在1/2 MS大量元素+1%(w/v)蔗糖的培养基中,孢子萌发为书带蕨型(Vittaria-type),配子体发育为水蕨型(Ceratopteris-type)。植物激素诱导配子体形成粘质、水浸状的黄绿色愈伤组织(Callus,C),但这些愈伤组织在GA3 0.1mg·L-1 +1/2 MS大量元素+3%蔗糖的固体培养基中不能分化形成孢子体。孢子在1/2 MS大量元素+1%蔗糖的固体培养基中培养约11周形成的配子体,其中有些配子体上形成一些乳白色的愈伤组织。这些愈伤组织能在GA3 0.1mg·L-1 +1/2 MS大量元素+3%蔗糖的固体培养基中分化形成胚状体,最终发育成完整的孢子体苗。组织细胞学观察发现,胚状体形态发生过程具有类似合子胚胎发育的四细胞期(Quadrant stage)、球形胚胎(Spherical-shaped embryo stage)、心形胚(Heart-shaped embryo stage)、鱼雷胚(Torpedo-shaped embryo stage)、成熟胚胎(Mature embryo)各阶段；胚状体发育早期就出现极性(Polarity)和管状分子(Tracheary elements,Tes)；同一培养物上可以看到不同发育时期和不同大小的胚状体。(2)傅氏凤尾蕨(Pteris fauriei Hieron.)在1/2MS固体培养中,傅氏凤尾蕨孢子萌发方式为书带蕨型,配子体发育是有些类似三叉蕨型(Aspidium-type)的一种,近成熟配子体腹面近凹口处分生区处有一个由许多颗粒状细胞组成并长有许多多细胞毛状体的突起结构,极少数配子体上此突起部位发现个别颈卵器(Archegonia)。孢子萌发和配子体发育都能耐受较大变化的酸性培养环境。傅氏凤尾蕨配子体形成孢子体都与上述突起结构有关；在无激素的1/2MS固体培养条件下,该结构除了长出极少数孢子体外,还形成愈伤组织且随着培养基中蔗糖浓度的增加(0~3%)而增多。温差(12h 15℃, 12h 25℃)使以上形成的愈伤组织生长减慢,质地变硬,颜色变白；这些愈伤组织能在GA3 0.1mg·L-1 +1/2MS大量元素+3%蔗糖的固体培养基中形成大量的胚状体最终发育成大量的孢子体；对这些愈伤组织及其正在分化培养基中形成的胚状体进行组织细胞学观察,发现有类似胚胎发育过程的各个阶段。而在1/2MS大量元素+6-BA 0.5 mg·L-1 + NAA 0.5 mg·L-1 +3%蔗糖的固体培养基中这些愈伤组织能增殖,继续培养只长出不定根,只有移植到以上含GA3 0.1mg·L-1的固体培养基中才能长出许多不定根和不定芽。(3)井栏边草(Pteris Muldifida Poir.)成熟的井栏边草孢子在以下几种固体无菌培养基中,都能萌发形成配子体并增殖呈绣球状：①在1/2MS大量元素+1%蔗糖的培养基中约8周可肉眼看到片状体,但萌发率较低,约4个月长出孢子体；②在1/2MS+3%蔗糖的培养基中6周可肉眼看到片状体,萌发率很低,未能形成孢子体；③在1/2MS无糖的培养基中5周可肉眼看到片状体,萌发率最高,约5个月长出孢子；④在含3%蔗糖的MS培养基中的一些配子体能形成暗黄透明状的愈伤组织,未能形成孢子体。井栏边草配子体能耐受较大变化的酸性培养环境。含0.5~4.0 mg·L-1的NAA和0.5~2.0 mg·L-1的6-BA液体培养能促进配子体增殖,其中以4.0 mg·L-1的NAA和2.0 mg·L-1的6-BA配比最佳。配子体液体增殖培养基中培养的配子体在转移到1/2MS固体培养基上能增殖并长出孢子体,而在MS固体培养基上却只增殖不长孢子体。这些配子体于激素诱导培养基中形成的愈伤组织在GA3 0.1mg·L-1 +3%蔗糖的1/2MS大量元素固体培养基中培养未能分化出孢子体。(4)岩凤尾蕨(Pteris deltodon Bak.)岩凤尾蕨成熟孢子接种到1/2MS +1%蔗糖+ pH6.5固体培养基,2周左右开始萌发,孢子萌发类型为书带蕨型,配子体发育类型为水蕨型,配子体约在第12周成熟,约第16周长出孢子体。1/2MS无糖培养基较适合岩凤尾蕨配子体发育和孢子体的形成。

目录

中文摘要

ABSTRACT

第1章 综述

1 药用蕨类植物

1.1 蕨类植物药用价值

1.2 蕨类药用成分研究

2 蕨类植物生殖和发育研究

2.1 配子体发育和增殖研究

2.2 配子体性器官发育研究

2.3 胚胎发育研究

2.4 无孢子生殖和无配子生殖

3 蕨类植物愈伤组织及孢子体诱导研究

3.1 植物愈伤组织

3.2 蕨类植物愈伤组织

3.3 蕨类植物孢子体诱导研究

4 植物形态发生和胚状体及其应用前景

4.1 植物形态发生

4.2 胚状体研究与应用

4.3 再生植株形态发生及其组织细胞学研究

4.4 胚培养

5 植物生物技术与药用植物开发利用

6 四种野生药用凤尾蕨的生物学特性及药用价值

6.1 大半边旗（Pteris dissitifolia Bak）

6.2 傅氏凤尾蕨（Pteris fauriei Hieron）

6.3 井栏边草（Pteris Muldifida Poir）

6.4 岩凤尾蕨（Pteris deltodon Bak）

第2章 孢子培养及配子体发育研究材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

2.1 试验材料处理

2.2 实验方法

2.3 培养条件

第3章 孢子培养及配子体发育结果与分析

1 大半边旗

1.1 配子体发育研究

1.2 孢子培养影响因素研究

2 傅氏凤尾蕨

2.1 配子体发育研究

2.2 孢子培养影响因素研究

3 岩凤尾蕨孢子培养和配子体发育研究

3.1 配子体发育研究

3.2 孢子培养影响因素研究

4 井栏边草孢子培养影响因素研究

第4章 配子体增殖研究材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

2.1 培养基

2.2 试验方法

第5章 配子体增殖结果与分析

1 井栏边草

1.1 液体培养基增殖培养

1.2 固体培养基增殖培养

2 傅氏凤尾蕨

第6章 配子体愈伤组织及孢子体诱导材料与方法

1 实验材料

1.1 大半边旗

1.2 傅氏凤尾蕨

1.3 井栏边草

2 实验方法

2.1 培养基

2.2 实验方法步骤

2.3 培养条件

第7章 配子体愈伤组织及孢子体诱导结果和分析

1 愈伤组织诱导结果和分析

1.1 大半边旗

1.2 井栏边草

2 孢子体诱导结果和分析

2.1 大半边旗

2.2 井栏边草

2.3 傅氏凤尾蕨

第8章 诱导孢子体形态发生的组织细胞学观察材料与方法

1 实验材料

1.1 大半边旗

1.2 傅氏凤尾蕨

2 实验方法

2.1 徒手切片制作

2.2 石蜡切片制作

2.3 拍照

第9章 诱导孢子体形态发生的组织细胞学观察结果与分析

1 大半边旗

1.1 形态学观察

1.2 细胞组织学观察

2 傅氏凤尾蕨

2.1 形态学变化

2.2 细胞组织学观察

第10章 总结与讨论

1 配子体发育和孢子培养影响因素

2 配子体增殖研究

3 配子体胚性愈伤组织

4 植物激素与配子体愈伤组织诱导孢子体形成

5 诱导胚状体及孢子体形态发生的组织细胞学观察

参考文献

附图

攻读硕士期间发表的与学位论文有关的论文目录

致谢