41Ca-AMS技术在生物体内钙吸收与分布中的示踪应用研究

摘要

长寿命放射性核素41Ca，因其辐射剂量小、天然本底低在生命科学领域是一种理想示踪剂。加速器质谱仪是一种综合了加速器、磁分析器、静电分析器和探测器等多个部件的质谱分析仪器，在分析41Ca时具有灵敏度高、样品量少、测量速度快的优势。鉴于钙是生物体中最重要的元素之一，所以41Ca-AMS技术在生命科学上具有广泛的应用。
　　骨质疏松是中老年人群中常见慢性疾病之一。绝经妇女患上骨质疏松的概率是同龄男性的2-7倍。补钙是临床上治疗骨质疏松的基本方案之一，但大剂量的钙剂易引发肾结石、心血管钙化等疾病。所以测量生物体对钙剂的吸收率对医学和营养学具有重要意义。以往测量钙吸收率的方法存在两点不足:1、因不能区分内源钙，导致测量结果是半定量的;2、利用45Ca、47Ca放射性核素标记内源钙库时具有一定的辐射损伤，而且因为半衰期较短不能长期开展研究工作。选用41Ca作为示踪剂，既可以标记内源钙库，又不会引起辐射损伤。能够实现精确测量钙吸收率的目的。本文选用大鼠作为研究对象，通过去卵巢手术建造骨质疏松模型。以41Ca作为示踪剂标记大鼠内源钙库，结合加速器质谱技术测量不同药物作用下，各组大鼠的钙吸收率，具体如下工作:
　　(1)SD大鼠骨质疏松模型的建立:三月龄SD雌性大鼠在动物房适应一周后，随机分组，OVX组进行去卵巢手术，sham组去除卵巢周围脂肪团。每天喂食低钙饲料，之后连续采集15天大鼠阴道分泌物、每周称量大鼠体重、每隔1个月进行眼眶取血。通过阴道分泌物及血清中的雌激素分别进行骨质疏松模型评价，结果发现雌激素在评价骨质疏松模型时因体内具有“代偿”现象而有一定局限性。
　　(2)41Ca内源钙库的标记及药物干扰:手术四个月后，将OVX组大鼠随机分为ABCD四组，随后在大鼠大腿肌肉内侧注射氯化钙溶液(含50ng41Ca)标记大鼠内钙库，同时将各组大鼠的饲料换成基础饲料（不含钙剂）、钙剂饲料（不含VD，但每公斤饲料含1000mg钙）、钙剂+VD饲料（每公斤饲料含1000mg钙和1000IU维生素D）、钙剂+VD+骨胶原饲料（每公斤饲料含1000mg钙，1000IU维生素D和10g骨胶原蛋白）;sham组喂食正常饲料。随后每隔一周记录大鼠体重，每隔1个月进行眼眶取血。每周称量48小时内大鼠所食饲料重量，并收集相应时间内大鼠粪便;注射41Ca后的第50天，所有大鼠喂食低钙基础饲料，同时收集对应时间内的大鼠粪便，其后换上各组原来的饲料。注射41Ca后的第71天，所有大鼠在收集48小时的粪便后，称重、麻醉、腹主动脉取血处死。取股骨、子宫等脏器称量质量后液氮冷却，放入-80℃冷藏。
　　(3)样品制备与测量:将收集的大鼠粪便和饲料烘干至恒重，并记录相应的质量。研磨后称取200mg进行微波消解，消解液放入4℃冰箱待测，利用原子吸收光谱测量消解液中的总钙。称量剩余的大鼠粪便，灰化后按体积比4∶1添加硝酸和双氧水后用电热板消解，最后将消解液制备氟化钙沉淀，装靶烘干后，利用AMS测量氟化钙中的41Ca/ Ca。根据公式测量B、C、D三组大鼠对钙的吸收率如下:(87.00±1.42)％;(83.81±0.83)％;(91.31±0.87)％;A组大鼠由于未补充钙剂无法计算钙吸收率。最终测量结果表明，联合钙剂、维生素D、骨胶原相对于单独钙剂作用更明显;通过各组大鼠粪便中41Ca/40Ca示踪结果显示，各组药物对骨钙流失均具有一定的减缓作用。
　　除了医用之外，示踪剂在农作物上也具有广泛用途。以桃树为例，钙剂对植物细胞壁具有重要作用。桃树成熟前缺钙会发生裂果，采摘后果肉较软，不易运输。这会造成很大的经济损失。通过示踪剂研究桃树中钙分布，可以为补钙奠定基础。2015年4月末在山东农业大学桃树基地，选取一棵11年生肥城桃桃树，通过树干注射硝酸钙溶液(含41Ca)，标记桃树，采集各时期枝条、叶片、果肉等器官，以及相同时期内枝条、叶片、新梢、树干等器官，经化学处理后，利用AMS测量各器官中的41Ca/Ca。结果表明:通过树干注射硝酸钙(含41Ca)的方法可以有效对桃树补充钙剂，超过60％的钙剂储存在树干，从树干中部到上部41Ca分布逐渐减少;叶片、枝条、果肉等器官对钙离子吸收主要在幼果细胞分裂期，从果实膨大期到果实成熟期叶片、果肉中钙含量一直不断减少，而多年生枝条中钙含量从膨大期到成熟期先是不断减少后期上升'成熟期桃树各器官41Ca分布结果表明蒸腾拉力大的器官中钙离子含量较高，其中新生器官中的钙离子浓度次序为:新梢＞果皮＞果肉。

目录

摘要

第一章 引言

1．1 研究背景及意义

1．2 钙同位素在生命科学中应用

1．2．1 45Ca、47Ca示踪生物体中的应用研究

1．2．2 钙双稳定同位素的示踪应用研究

1．2．3 41Ca在生物体中的示踪应用研究

1．3 本工作的预期目标

第二章 加速器质谱仪原理及41Ca的测量研究

2．1 加速器质谱工作原理

2．2．加速器质谱技术发展进程

2．2．1 第一代基于大型加速器的AMS

2．2．2 第二代低能专业化AMS

2．2．3 第三代小型化的AMS

2．3 中国原子能科学研究院HI-13加速器质谱仪

2．3．1 离子源与注入器

2．3．2 加速器

2．3．3 高能分析器

2．3．4 离子探测器

2．4 41Ca的AMS测量

2．4．1 AMS测量41Ca实验参数的选择

2．4．2 AMS测量41Ca具体步骤

2．4．3 AMS测量41Ca数据处理

2．5 小结

第三章 41Ca-AMS技术在骨质疏松大鼠补充钙剂过程中示踪应用研究

3．1 背景介绍

3．2 实验方案

3．2．1 钙剂与维生素D剂量的选择

3．2．2 骨胶原的选择

3．2．3 41Ca测量钙吸收率的计算方法

3．3 骨质疏松大鼠模型建造

3．3．1 材料

3．3．2 骨质疏松模型的建造

3．3．3 41Ca标记骨质疏松大鼠内源钙库模型建立

3．3．4 药物干扰及样品收集

3．4 生物指标结果及分析

3．4．1 动物实验期间各组大鼠体重变化

3．4．2 骨质疏松模型检测

3．5 SD大鼠粪便样品的制备

3．5．1 仪器、试剂与器皿

3．5．2 41CaF2粪便样品制备

3．5．3 饲料、粪便Ca2+溶液制备流程

3．6 总钙的AAS的测量

3．6．1 AAS原理简介

3．6．2 AAS实验条件与预实验

3．6．3 AAS实验结果与分析

3．7 41Ca测量结果、应用与分析

3．7．1 41Ca结果与分析

3．7．2 钙真实吸收率

3．7．3 41Ca在药物药效评价中的结果与分析

3．8 实验小结与讨论

第四章 41Ca-AMS技术在桃树补充钙剂过程中的示踪应用研究

4．1 背景介绍

4．2 试验部分

4．2．1．主要仪器与装置

4．2．2 主要材料与试剂

4．3 试验方法

4．3．1 桃树标记、样品制备与测量

4．3．2 计算方法

4．4 结果与讨论

4．4．1 各时期枝条、叶片、果肉等器官41Ca／Ca含量变化

4．4．2 成熟期肥城桃各器官内41Ca的分布

4．5 小结

第五章 总结与展望

参考文献

致谢

附录

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