沙田柚自交和异交花柱转录组测序及核糖核酸酶基因(cgSLA、cgSRA)的克隆与表达分析

摘要

沙田柚（Citrus grandis var.shatinyu）是广西的名优水果之一，因其品质优良和较高的营养价值而广受人们的欢迎。但是，沙田柚属于高度配子体自交不亲和的果树，自然坐果率很低，因而要依靠人工异花授粉来提高产量。本研究以未授粉、自交和异交1d、2d、3d的花柱为试材，提取RNA，构建cDNA文库，运用第二代高通量测序技术对其进行转录组测序。随后，对测序结果进行GO功能注释、Pathway通路分析和表达量计算，从中选择出可能与沙田柚自交不亲和有关的核糖核酸酶基因Unigene34907_All（cgSLA）和Unigene2441_All（cgSRA），构建植物表达载体，转入拟南芥，对其基因功能进行验证。本论文的结果如下:
　　1.样品通过提取RNA，构建cDNA文库，最终得到总Unigene90214个，总长142142835nt，平均长度1576nt，N50长度为2413nt。
　　2.获得的Unigene与NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、COG、GO数据库比对后，分别有62679、59673、41897、39362、28317、50701条比对到该数据库。通过COG功能分类，获得的Unigene被归类到25个功能类别。其中被归类到通用功能、转录相关功能的Unigene数目最多。
　　3.GO功能富集分析和Pathway代谢通路富集分析的结果表明，获得的Unigene分别被归类到55个GO功能类别和128个代谢通路。CDs预测共获得了62752条CDs，其中比对六大数据库获得61707条，而用软件ESTScan预测得1045条。
　　4.通过SSR分析共获得29055个SSR，其中单碱基重复最多，共有12746个。通过SNP分析，在7个样品中，未授粉花柱的SNP数为47145;异交1d花柱为53617，异交2d花柱为54143，异交花柱为52717;自交1-3d花柱分别为50606、54005和53816个。
　　5.从自交和异交花柱中筛选到差异表达的核糖核酸酶基因38个。从中选择了可能与沙田柚白交不亲和有关的两个基因Unigene34907_All（cgSLA），Unigene2441_All（cgSRA）。构建植物表达载体，利用花絮浸染法转化拟南芥，PCR和测序的结果表明基因已整合到拟南芥基因组。
　　6.RT-PCR验证结果表明，8个沙田柚花柱差异表达的表达趋势与转租测序结果相同。
　　7.对自交和异交花柱转录组测序所得基因进行差异表达分析发现，这些基因主要与植物激素的信号传导途径，或胁迫应答反应有关。

目录

摘要

第1章 前言

1．1 植物自交不亲和概述

1．2 转录组测序技术

1．2．1 转录组测序的应用

1．3 研究目的与意义

第2章 材料与方法

2．2．3 cDNA文库的制备

2．3 沙田柚转录组数据处理

2．3．1 数据过滤

2．3．2 序列拼接

2．4 沙田柚转录组分析

2．4．1 基因的比对及功能注释

2．4．2 基因表达差异分析

2．5 沙田柚转录组SSR和SNP分析

2．6 RT-PCR验证

2．7 沙田柚核糖核酸酶基因的差异表达分析

2．8 核糖核酸酶基因(cgSRA、cgSLA)的克隆与表达载体构建

2．8．1 目的基因扩增

2．8．2 TA29启动子的克隆

2．8．3 表达载体的构建

2．8．4 表达载体的鉴定

2．9 核糖核酸酶基因(cgSRA、cgSLA)的转化

2．9．1 拟南芥的种植

2．9．2 浸染与培养

2．9．3 种子收集与筛选

2．9．4 转基因植株栽培

2．9．5 转基因植株的鉴定

第3章 结果

3．1 RNA的质量检测

3．2 沙田柚花柱转录组数据的分析

3．2．1 测序质量的评估

3．2．2 RNA-seq序列组装结果

3．2．3 RNA-seq序列比对结果

3．3 Unigene表达差异分析

3．3．1 差异表达基因的GO显著功能富集分析

3．3．2 自交与异交花柱差异表达基因的pathway显著富集分析

3．4 SSR和SNP分析

3．4．1 SSR分析

3．4．2 SNP分析

3．5 荧光定量PCR验证

3．6 核糖核酸酶的差异表达分析

3．7 核酸酶基因克隆与转化验证

3．7．1 基因与启动子克隆

3．7．2 表达载体的鉴定

3．7．3 转化植株的鉴定

3．7．4 cgSLA和cgSRA基因的生物信息学分析

第4章 讨论

4．1 沙田柚转录组测序

4．2 沙田柚自交不亲和相关的基因

4．2．1 核糖核酸酶基因

4．2．2 激素相关基因

4．2．3 蛋白激酶相关基因

4．3 核糖核酸酶基因的功能验证

第5章 结论与展望

参考文献

附录

硕士期间发表论文

致谢

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