原发性肝癌围手术期肝移植患者外周血环状RNA的差异表达研究

摘要

肝脏是身体内极其重要的代谢器官，其功能的失调会影响机体正常的新陈代谢和内环境的变化。原发性肝癌(Primary Liver Cancer，PLC)是一类发生于肝脏的恶性肿瘤，一般由化学致癌物或环境因素引发的慢性肝病或肝硬化发展而来，但是目前发病机制还未阐明，病理诊断和治疗手段有一定的局限性。同种异体肝移植是目前治疗PLC最彻底、有效的方法，但如何提高供肝利用率和受者生存率一直也是医疗界所面临的问题。因此，迫切需要发现用于PLC早期诊断以及治疗作用评估的新生物标记物。
　　近年来，随着分子生物学基因芯片技术的发展，越来越多的研究者利用该技术探索了各类生物小分子与疾病的关系，而环状RNA（circular RNA，circRNA）是目前研究重大疾病分子机理的热点。circRNA是一类保守性好、特异性高，对靶基因能发挥调控作用的内源性非编码RNA，利用circRNA微阵列芯片技术，对circRNA进行表达谱的构建，筛选出具有差异表达的circRNA作为疾病相关的生物标志物，并对其进行功能研究，可以使我们更好地了解疾病发生的分子机制，进而提高相关疾病的预防和诊断水平。
　　目的:利用circRNA微阵列芯片分析围手术期PLC肝移植患者和健康对照者外周血circRNA表达谱，通过比较未实施肝移植术前患者与实施肝移植术后患者、健康对照者之间差异性表达的circRNA，筛查PLC特异表达的circRNA以及移植术后早期肝功能恢复相关的circRNA，为PLC早期诊断、预后以及治疗提供新的信息。
　　方法:收集2014年12月1日至2015年8月31日于中国人民解放军第一八一医院确诊为PLC并进行肝移植手术，且治疗效果较好的4例患者的临床资料及外周血标本，其中患者外周血标本分为术前组（采集于PLC患者肝移植术前1天）、术后组（采集于患者肝移植术后1天、术后3天、术后7天）。健康对照组4例外周血标本采集于与PLC患者年龄、性别和民族等匹配的健康人群。利用Trizol法提取总RNA，使用NanoDrop ND-1000检测RNA是否降解并测定RNA浓度;采用circRNA微阵列芯片分析PLC患者肝移植围手术期和健康对照者circRNA表达谱。对肝移植术前组、术后组以及健康对照组表达的circRNA进行组间差异比较，筛选出与PLC特异表达以及移植术后早期肝功能恢复相关的circRNA。最后，应用RT-PCR验证circRNA微阵列芯片分析的准确性，并利用miRNA靶向结合位点预测软件预测与miRNA吸附相关的circRNA，分析circRNA的功能。
　　结果:(1)在肝移植术前与术后自身对照比较研究中，PLC患者肝移植术后组（术后1天、3天、7天）circRNA归一化均值/PLC患者肝移植术前组circRNA归一化数值≥2.0（fold change≥2.0）的circRNA有120个，说明这120个circRNA在肝移植术后组中上调表达。PLC患者肝移植术后组（术后1天、3天、7天）circRNA归一化均值/PLC患者肝移植术前组circRNA归一化数值≤-2.0(fold change≤-2.0)的circRNA有182个，说明这182个circRNA在肝移植术后组中下调表达。
　　(2)在PLC肝移植术前、术后分别与健康对照组比较研究中，术前组circRNA归一化数值/健康对照组circRNA归一化数值≥2.0∩术后组circRNA归一化均值/术前组circRNA归一化数值≤-2.0的circRNA有165个;术前组circRNA归一化数值/健康对照组circRNA归一化数值≤-2.0∩术后组circRNA归一化均值/术前组circRNA归一化数值≥2.0的circRNA有80个。
　　(3)165个circRNA在机体存在肿瘤时表达上调，实施PLC肝切除及肝移植术后表达下调，可能是与PLC相关生物标记物，miRNA靶向结合位点预测软件分析发现其中的hsa_circRNA_102347与miR-203存在相互作用位点，且已有文献报道miR-203为肝癌特异性表达miRNA。而80个circRNA在机体存在肿瘤时表达下调，实施PLC肝切除及肝移植术后表达上调，推测其可能与肝移植术后早期肝功能恢复有关，miRNA靶向结合位点预测软件分析发现其中的hsa_circRNA_400031与miR-483-5p存在相互作用位点，且已有文献报道miR-483-5p与肝癌发生发展存在密切的关系。
　　(4) RT-PCR验证表明 hsa_circRNA_400031、 hsa_ circRNA_102032、hsa_circRNA_103096和hsa_circRNA_102347的表达情况与芯片分析结果基本一致。此外， RT-PCR检测发现 hsa_circRNA_102032、 hsa_ circRNA_103096和hsa_circRNA_102347在肝移植术前组的表达量相对于健康对照组极其显著上调(p＜0.01)，并且在肝移植术后1天、3天、7天有着显著下调的趋势，可能是机体PLC切除及肝移植预后相关的生物标记物。
　　结论:(1) PLC患者实施肝摘除和肝移植前后存在大量差异表达circRNA，它们与miRNA相互作用，可能与PLC的病理过程以及移植治疗作用密切相关。
　　(2) hsa_circRNA_400031、 hsa_circRNA_102032、 hsa_ circRNA_103096和hsa_circRNA_102347可能是PLC早期诊断以及肝移植术后预后相关标志物。

目录

摘要

第1章 绪论

1．2 circRNA的主要功能

1．3 circRNA与恶性肿瘤疾病的关系

1．4 circRNA为某些疾病治疗提供新思路

1．5 circRNA表达谱分析技术路线

第2章 材料与方法

2．2．1 实验试剂

2．2．2 主要仪器

2．3 实验方法

2．3．1 外周血标本的收集

2．3．2 样品的制备与评估

2．3．3 样本相关circRNA的筛选鉴定

2．3．4 实时荧光定量PCR检测

第3章 结果

3．2 PLC患者肝移植围手术期和健康对照者circRNA表达谱数据分析

3．3 差异表达的circRNA与miRNA位点结合的预测

3．4 候选circRNA的确定

3．5 RT-PCR检测circRNA结果

3．5．1 引物验证

3．5．2 RT-PCR检测结果分析

3．5．3 RT-PCR验证结果分析

第4章 讨论

4．1 外周血样本收集和保存

4．2 课题研究方法

4．3 circRNA实验结果

第5章 结论与展望

5．1 结论

5．2 不足之处及展望

参考文献

附录

攻读硕士期间发表论文情况

致谢

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