板栗疫病菌脱毒方法比较及受病毒侵染后与症状表达有关的靶标基因的克隆

摘要

病毒与宿主相互作用是现代病毒学研究最重要的前沿领域之一.该文采用具有独特优点的一个崭新的病毒/宿主模型系统一低毒病毒/板栗疫病菌系统来研究病毒与宿主的相互作用.建立了板栗疫病菌的原生质体再生脱毒方法,该方法可望应用到其他具有工农业重要使用价值的感染病毒真菌的脱毒纯化.通过用EP155单交换随机整合质粒文库转化低毒的板栗疫病菌工程菌株LC1,构建了突变体库,并以孢子形成为标记,从突变体库中筛选到了一批携带病毒且产孢良好的病毒靶基因突变株.通过对突变株B910 Southern杂交分析确定为单插入突变.质粒拯救获得了突变基因片段,对该基因片段序列分析表明,该基因(命名为cpta1)的编码产物与炭疽菌Colletotrichum lindmuthianum中的转录激活因子CLTA1有64％的同源性和75%的相似性.这些结果暗示CPTA1可能是低毒病毒的一个靶标,其功能因病毒侵染而发生改变并且干扰真菌的正常产孢过程.

目录

文摘

英文文摘

第一章前言

1.病毒与宿主相互作用的分子机制

1.1宿主因子对病毒的作用

1.2病毒对宿主的作用

1.3病毒与宿主研究的模型系统

1.4需要解决的问题

2.低度病毒/板栗疫病菌系统

2.1低毒病毒和板栗疫病菌研究简介

2.2板栗疫病菌

2.3低毒病毒/板栗疫病菌系统的特点和已积累的知识

2.4板栗疫病菌的生物防治

2.5病毒的脱毒研究

3.本论文拟解决的问题

3.1低毒病毒在真菌不同生长阶段或状态下的脱毒

3.2与病毒侵染引起的症状表达有关的宿主靶基因的发现和克隆

第二章真菌脱毒方法的比较研究

1.材料

1.1板栗疫病菌菌株

1.2培养基及培养条件

2.方法

2.1光诱导产孢

2.2原生质体的再生

2.3尖端分离法

3.结果与分析

3.1带毒菌株与不带病毒菌株的形态特征比较

3.2光照诱导分生孢子的脱毒

3.2原生质体再生脱毒

3.3尖端切离继代培养脱毒

4.讨论

第三章板栗疫病菌受病毒侵染后与症状表达有关的靶标基因的克隆

1.材料

1.1板栗疫病菌菌株

1.2细菌菌株

1.3质粒

1.4 EP155单交换随机整合质粒文库

1.5抗生素及其使用浓度

1.6常用溶液及缓冲液

2.方法

2.1质粒大量提取

2.2板栗疫病菌总DNA的提取

2.3目的DNA片段的分离和回收

2.4载体去磷酸化

2.5连接反应

2.6 RbCl2制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞

2.7热击法转化

2.8 LC1突变体库的构建

2.9突变株的纯化

2.10突变株dsRNA的检测

2.11DNA的酶切

2.12琼脂糖凝胶电泳

2.13 Southern杂交

2.14质粒拯救

2.15亚克隆

2.16测序

3.结果与分析

3.1质粒pUCHyg的构建

3.2 EP155单交换随机整合文库的构建

3.3 EP155单交换随机整合文库的质量分析

3.4板栗疫病菌突变体库的构建

3.5产孢突变株的筛选纯化

3.6突变株的分子鉴定

3.7质粒拯救

3.8 pRB910质粒的亚克隆

3.9 pUCB910克隆文库的测序结果

3.10突变基因的初步分析

4.讨论

4.1用EP155单交换随机整合文库进行插入诱变获得突变体的筛选

4.2用单交换随机整合质粒文库获取突变体的效率

4.3关于质粒拯救

4.4突变株和突变基因

参考文献

附录 实验中用到的主要要仪器

致谢