部分苏铁种类亲缘关系的ISSR分析及分类学研究

摘要

苏铁类植物作为古老的种子植物，极具观赏和科研价值。目前，部分种类的分类地位争议较大，本研究利用ISSR分子标记的方法研究部分苏铁种类的亲缘关系及分类学问题，主要研究结果如下： 1、CTAB改良法可以快速提取苏铁基因组DNA，提取的DNA质量高，达到ISSR分子标记的试验要求。 2、用正交设计法结合单因素设计法有效地建立了苏铁ISSR-PCR优化反应体系。在20μl的反应体系中：1×Buffer；DNA模板75ng；dNTPs25μmol·L-1；Taq DNA聚合酶1.0U/反应；引物0.2μmol·L-1；Mg2+2.5mmol·L-1；不足体积用双蒸水补足；反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，循环40次，72℃延伸10min，4℃保存。 3、从100条引物中筛选出11条扩增谱带清晰、重复性和稳定性好的多态性片段的引物，11条引物共扩增出132条带，其中115条为多态性条带，多态性为87.1％，很好的揭示了供试的29个苏铁种的遗传差异和亲缘关系。聚类结果显示隆林苏铁与叉孢苏铁，长柄叉叶苏铁与多羽叉叶苏铁，台湾苏铁与海南苏铁，苏铁与台东苏铁，越南蓖齿苏铁与蓖齿苏铁这五组形态上相似处较多的苏铁种类表现出了较近的亲缘关系，泽米铁科的鳞秕泽米铁与苏铁科的种类间亲缘关系远，叉叶苏铁和多歧苏铁亲缘关系较近，而与长柄叉叶苏铁和多羽叉叶苏铁亲缘关系远，表现出地理分布位置相近的种类亲缘关系较地理位置远的种类近。 4、本研究的29个苏铁种类的相似性系数在0.40-0.83范围内，说明材料间存在着较大的遗传差异。根据确立的亚种、变种和变型的等级指标系数，确立了各苏铁种类的分类地位，其中西林苏铁和长球果苏铁作为叉孢苏铁的亚种，叉孢苏铁为其原亚种；隆林苏铁是叉孢苏铁的一个变种，而叉孢苏铁为其原变种；广东苏铁、台湾苏铁、四川苏铁为独立的三个种；海南苏铁为台湾苏铁的变种，台湾苏铁为原变种；长柄叉叶苏铁应为独立的种，而多羽叉叶苏铁应为长柄叉叶苏铁的变型，长柄叉叶苏铁为原变型；多歧苏铁作为叉叶苏铁的变种，叉叶苏铁为原变种；叉孢苏铁与多歧苏铁的遗传差异达到变种水平；短叶苏铁和锈毛苏铁为石山苏铁的两个亚种，石山苏铁则为原亚种；元江苏铁、宽叶苏铁是两个独立的种；十万大山苏铁、滇南苏铁与宽叶苏铁的差异水平分别达到变种和亚种水平；一些分类地位明确的种类与苏铁其它种类虽在表型性状上存在较大差异，但相似性系数有不少也达到亚种或变种的水平，从这个角度看，有争议的那些苏铁种类，其实与过去一贯认为是可以成立为种一级分类地位的那些没有过什么争议的种类，在各个种类之间的遗传差异水平上是一样的，没有任何特殊之处，我们对这些虽然过去没有过任何争议，但遗传物质组成差异不是在种的水平，而是已经在亚种、变种和变型水平的种，也给予了调整其分类地位的建议，以便更好地认识这些苏铁植物相互间的亲缘关系，更好地制订出苏铁类植物的保护策略和更有效地加以利用。

目录

文摘

英文文摘

声明

1前言

1.1立题依据

1.1.1苏铁科植物资源的现状与分布

1.1.2苏铁科植物的地位与价值

1.1.3观赏价值和生态效益

1.1.4苏铁遗传多样性和亲缘关系研究的学科效益

1.2立题背景与分类研究现状分析

1.3苏铁属植物的分类现状

1.3.1形态解剖学研究

1.3.2细胞学研究

1.3.3生化研究

1.3.4 DNA水平上的研究

1.4以往研究中尚存在的问题

1.5 DNA分子标记研究进展

1.6 ISSR分子标记的原理和特点

1.7研究的目的意义及内容

1.7.1目的及意义

1.7.2主要内容

1.7.3技术路线

2材料与方法

2.1材料与试剂

2.1.1试验材料

2.1.2试剂

2.1.3主要试剂配制

2.1.4主要仪器设备

2.2试验方法

2.2.1基因组DNA提取纯化方法

2.2.2基因组DNA质量检测

2.2.3苏铁ISSR-反应体系的建立

2.2.4 ISSR扩增产物的检测

2.2.5数据统计与分析

3结果与分析

3.1苏铁基因组DNA提取方法的比较

3.1.1紫外分光光度检测

3.1.2电泳检测

3.2正交设计优化ISSR-PCR反应体系

3.2.1探索性正交试验直观结果与分析

3.2.2细调性正交设计直观观察结果与分析

3.3单因子试验结果分析

3.3.1 DNA模板量对ISSR-PCR的影响

3.3.2退火温度对ISSR-PCR的影响

3.3.3循环次数对ISSR-PCR的影响

3.3.4 ISSR-PCR体系稳定性的检测结果

3.4引物的筛选

3.5 ISSR遗传多样性水平分析

3.6相似性系数和聚类结果分析

4讨论

4.1苏铁基因组DNA提取方法的比较

4.2苏铁ISSR-PCR体系的建立

4.3 29个苏铁植物种间的亲缘关系

4.4各种类的分类地位

4.4.1西林苏铁、长球果苏铁、隆林苏铁和叉孢苏铁

4.4.2广东苏铁、海南苏铁、台湾苏铁和四川苏铁

4.4.3叉叶苏铁、多歧苏铁、长柄叉叶苏铁、叉孢苏铁和多羽叉叶苏铁

4.4.4越南蓖齿苏铁、蓖齿苏铁和暹罗苏铁

4.4.5石山苏铁、短叶苏铁和锈毛苏铁

4.4.6元江苏铁、十万大山苏铁、滇南苏铁和宽叶苏铁

4.4.7其它部分苏铁种的分类学问题分析

5结论

致谢

参考文献

附录