农杆菌介导甘蔗ACC氧化酶基因的遗传转化研究

摘要

根据己报道的甘蔗ACO基因的序列，在读码框外设计特异引物，通过RT-PCR技术，克隆了甘蔗ACO基因编码区969bp的cDNA片段，分别正向和反向插入植物表达载体pBI121的CaMV35S启动子和NOS终止子之间，构建了ACO基因的正义植物表达载体pBIaco和反义植物表达载体pBIantiaco，该载体的抗性选择标记为NPT Ⅱ基因。 利用冻融法分别将正义植物表达载体pBIaco和反义植物表达载体pBIantiaco导入根癌农杆菌菌株EHAl05中，通过农杆菌介导法，将ACO正、反义基因导入烟草K346。经PCR筛选，获得34株正义和28株反义转基因植株，转化率分别为24％和31％。取部分PCR阳性植株进行Dot-Southem杂交检测，证明外源基因已整合入烟草的基因组中。采用气相色谱法对转基因烟草进行内源乙烯释放量测定，结果显示，正义转基因烟草的乙烯释放比对照平均增加77.22％，而反义转基因烟草的乙烯释放量仅为对照的31.67％，达到极显著差异。说明甘蔗ACO正、反义基因可在异源真核系统中实现功能性表达。转基因烟草移栽后，反义转基因烟草表现出前期生长延缓、后期开花延迟特性，正义转基因烟草表现出前期生长快、后期开花早特性。 通过农杆菌介导法将ACO反义基因遗传转化甘蔗ROC22，经过G418抗性筛选，获得19株抗性植株。对选择标记NPTⅡ基因进行PCR检测，有2株呈现阳性，该阳性转基因植株生长状况较野生型和PCR阴性的植株差，生长迟缓，矮化。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

1前言

1.1 ACC氧化酶与乙烯的生物合成

1.1.1乙烯的生物合成途径

1.1.2植物ACO基因及其分子生物学研究

1.2乙烯对甘蔗生长发育的调控

1.2.1乙烯利在甘蔗生产上的应用

1.2.2乙烯对甘蔗生长发育的生理生化研究

1.3甘蔗转基因技术

1.3.1实现甘蔗遗传转化的方法

1.3.2甘蔗遗传转化的国内外研究现状

1.3.3影响遗传转化成功与否的因素

1.4本研究的目的意义及内容

2甘蔗ACC氧化酶基因的克隆与植物表达载体构建

2.1材料

2.1.1植物材料

2.1.2质粒与菌种

2.1.3酶与试剂

2.1.4主要仪器设备

2.2方法

2.2.1甘蔗ACO基因编码区cDNA序列的克隆

2.2.2甘蔗ACC氧化酶正、反义基因植物表达载体的构建

2.3结果与分析

2.3.1 RNA的完整性

2.3.2 PCR产物的鉴定

2.3.3甘蔗ACO cDNA的序列比较

2.3.4甘蔗ACC氧化酶cDNA植物表达载体的鉴定和分析

2.4讨论

3农杆菌介导甘蔗ACC氧化酶正、反义基因遗传转化烟草研究

3.1材料与方法

3.1.1材料与试剂

3.1.2方法

3.2结果与分析

3.2.1根癌农杆菌的转化与鉴定

3.2.2烟草叶片组织对卡那霉素的敏感性

3.2.3转基因烟草植株的获得及其性状表现

3.2.4农杆菌介导烟草转化效率

3.2.5转基因植株的PCR鉴定

3.2.6转基因植株的 Dot-Southern检测

3.2.7转正、反义甘蔗ACO基因烟草叶片乙烯释放量的测定

3.3讨论

4农杆菌介导ACC氧化酶反义基因遗传转化甘蔗初步研究

4.1材料与方法

4.1.1材料与试剂

4.1.2方法

4.2结果与分析

4.2.1甘蔗胚性愈伤组织的诱导

4.2.2甘蔗对G418的敏感性

4.2.3农杆菌介导法转化甘蔗的结果

4.2.4抗性植株的PCR检测

4.3讨论

5结论与展望

5.1研究总结

5.2后续研究

致谢

参考文献

附录