牛乳腺特异性表达人溶菌酶基因载体构建与表达检测

摘要

亚热带地区气候炎热，奶牛易发乳房炎，本文构建了奶牛乳腺特异性表达人溶菌酶(hLZ)基因的载体并在乳腺细胞进行验证。参照hLZ基因序列(GenBank:NM_000239.2)设计引物，采用RT-PCR的方法从人胎盘组织中成功扩增克隆了长406bp的hLZ基因成熟肽片段。应用实验室已有的娟姗牛乳腺特异性表达调控元件，经过多步酶切-连接-转化-筛选-鉴定，构建了奶牛乳腺表达hLZ的载体pBCN5.2-hLZ-I.I-EGFP-neo(13.6kb)和pBCN-3.8-hLZ-1.1-EGFP-neo(12.2kb)，经过酶切、PCR和测序验证载体构建正确。将构建的2个载体瞬时转染Bcap细胞，24h后可以观察到EGFP表达的细胞，然后纯化细胞总RNA，通过实时定量PCR检测比较hLZ的表达丰度，结果显示，pBCN5.2-hLZ-1.1-EGFP-neo载体相对表达量为0.89±0.04，pBCN-3.8-hLZ-1.1-EGFP-neo为0.62±0.05，前者表达效率较高，但差异不显著。将线性化的pBCN5.2-hLZ-1.1-EGFP-neo载体转染Bcap细胞筛选后获得阳性细胞克隆，扩增培养后纯化总蛋白进行SDS PAGE电泳，与空白对照相比在14KD附近出现一条特异蛋白条带，western blot结果显示出14KD的特异性条带，表明表达产物具有天然hLZ的抗原性。上述结果表明，构建的载体能够在乳腺细胞水平表达人hLZ基因，为获得自然抵抗乳房炎的转基因奶牛奠定了工作基础。