能够在苏云金芽孢杆菌营养期表达的载体的构建及新型杀虫蛋白基因vip的鉴定

摘要

本研究的工作内容分为两个部分,一个是苏云金芽孢杆菌营养期表达载体的构建并使用构建好的载体在苏云金芽孢杆菌无晶体突变株中表达cry1Ac31基因。另外一个是鉴定新型杀虫蛋白基因vip。
　　 在第一部分的工作中,我们以苏云金芽孢杆菌cry3Aa基因启动子为模板,设计了一对引物(C3-5/C3-3),并利用这对引物从苏云金芽孢杆菌拟步虫甲亚种(Bt subsp.tenebrions)中扩增出575bp的DNA片段。测序结果显示它与预计的启动子片段一致,含有能够在Bt中表达的元件。利用平末端连接,我们将该DNA片段克隆到穿梭质粒载体pBU4上,构建了一个新的表达载体pBUC3。随后通过电转化,我们将含有cry1Ac31基因的表达载体转进Bt无晶体突变株IPS。利用PCR、镜检和SDS-PAGE进行验证。结果表明cry1Ac31基因得到了很好的表达。
　　 在第二部分的工作中,我们设计了5对通用引物,采用PCR的方法鉴定vip基因。在对本实验室分离的204株苏云金芽孢杆菌的总DNA进行鉴定后,发现菌株S1561-1使用引物vip2-5/vip2-3进行PCR反应时,会出现1200bp左右条带,与预计大小一致。为了了解S1561-1蛋白分泌情况,随后我们对其进行了SDS-PAGE验证,验证结果表明在菌体培养16小时后,就会产生80kDa左右的蛋白带,符合Vip蛋白的特征。送样测序后,在线blastn分析结果显示该序列与vip1和vip2基因没有同源性,利用生物信息学进行分析后也发现,这段序列没有足够长的ORF,并不能编码80kDa左右大小的蛋白质。