陆地棉对河南商丘强致病力棉花黄萎病菌的抗性反应研究

摘要

为了探讨陆地棉对黄萎病菌的抗性机理,本研究首先从河南商丘地区的棉花病株中分离并鉴定出了强致病力棉花黄萎病菌,进而分析了陆地棉受黄萎病菌侵染后蛋白质表达及保护酶系活性的变化,探讨了棉花NBS抗病基因对病原菌的抗性反应,构建了棉花病毒诱导基因沉默体系。得出如下主要结果:
　　 1强致病力棉花黄萎病菌的收集、分离鉴定及致病型分析
　　 对商丘地区棉花上的8株单孢菌株,从菌落形态、显微结构、致病力、内转录间隔区(Internal transcribed spacer,ITS)序列、系统进化及菌体蛋白质等方面进行了分析。菌落形态、显微结构及ITS序列分析表明,这些菌株属于棉花黄萎病菌Verticilliumdahliae;利用ITS序列构建系统进化树,结果显示8株菌株并没有聚在同一进化枝上;致病力分析显示8株黄萎病菌菌株存在致病力差异,SQ4菌株致病力最强,属于落叶型,而致病力最弱的SQ1菌株,属于非落叶型;菌体蛋白质SDS-PAGE分析表明,不同致病力的菌株间蛋白质谱带存在差异。
　　 2陆地棉被强致病力菌株SQ4侵染后蛋白质表达及保护酶系活性的变化
　　 分析了陆地棉被SQ4侵染前后PR蛋白质的变化、活性氧及保护酶系在不同抗性品种中的差异。双向电泳分析结果显示,陆地棉品种中棉41植株被SQ4侵染后和对照间存在蛋白质点的有无及表达量多少的差异;半定量分析发现,在抗性品种和耐病品种中,几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶两种酶的表达量明显增加,表明这两种酶与棉花对黄萎病的抗性反应密切相关:但其它两种PR蛋白质(PR1和Ⅲ型几丁质酶)并未参与棉花黄萎病的抗性反应,说明不同的植病系统中参与抗性反应的PR蛋白质可能不同。对活性氧和保护酶系活性变化的研究表明,参与抗性反应的保护酶体系存在差异。
　　 3棉花NBS抗病基因的发掘
　　 根据已克隆的R基因的保守序列设计引物,在棉花不同抗性品种中克隆出500bp左右大小的片段,测序并在NCBI上进行Blast分析,发现这些序列除一个序列外都和已经克隆的抗病基因类似物(RGAs)的同源性高达98％以上;以克隆到的RGAs和植物中已经克隆的几个典型的R基因序列建立了进化树,可将棉花中的RGAs序列分别聚在三个不同的亚家族,但这些序列片段的功能需要通过后续的功能验证来确定。本研究还利用NBS-Profling技术,从棉花中克隆出一个NADH基因片段,该基因和棉属的NADH基因同源性高达93％。
　　 4棉花病毒诱导基因沉默体系构建
　　 在棉花上用病毒诱导基因沉默是一种基因功能验证的新方法,2008年John应用棉花皱叶病毒建立了病毒诱导基因沉默体系,但目前国内棉花病毒载体的研究比较少。本研究探索了两个病毒诱导基因沉默载体在棉花上的应用,由烟草脆裂病毒(TRV)改造的PTV00载体和棉花皱叶病毒(CL,CrV)改造的pJRTCL,CrV载体,应用棉花PDS标记基因评价了两个载体的沉默效果,从而成功建立棉花病毒诱导基因沉默体系。