产耐高温β-淀粉酶枯草芽孢杆菌工程菌的构建

摘要

β-淀粉酶(β-Amylase，EC3.2.1.2)又称为α-1，4-葡聚糖-麦芽糖水解酶，作用于淀粉和糖原时可水解非还原性末端的α-1，4-糖苷键得到麦芽糖。β-淀粉酶在酿造、食品、医药、淀粉糖等工业具有重要用途，用于生产高麦芽糖浆、超高麦芽糖浆、结晶麦芽糖、医用针剂麦芽糖、麦芽糖醇等。
　　 β-淀粉酶可从植物和微生物中获得。目前已商品化的主要是植物来源的β-淀粉酶，多从一些高等植物如大麦、小麦、黑麦、大豆的种子和甘薯的块茎中提取，需要消耗大量的粮食。因此通过微生物发酵生产β-淀粉酶是比较好的选择，而且微生物来源的β-淀粉酶更有利于规模化生产。
　　 本论文采用PCR克隆了枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的P43启动子，将来源于短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的α-乙酰乳酸脱羧酶基因信号肽DNA片段和来源于高温产硫化氢梭状芽孢杆菌（Clostridium thermosulfurogenes）的β-淀粉酶基因全合成，将此β-淀粉酶表达元件克隆到整合质粒pMLK83，然后通过同源重组将β-淀粉酶表达元件交换至枯草芽孢杆菌WB600染色体中并同时敲除了宿主菌的α-淀粉酶基因，成功构建了分泌表达耐高温β-淀粉酶的整合型重组枯草芽孢杆菌WB600[CTBA]。在不加抗生素的LB培养基上37℃摇瓶培养时，重组菌WB600[CTBA]的发酵产酶活力在培养至44h时达到最高值216.4U/mL，胞外分泌率在培养至16h时达到69.0％。表达的重组β-淀粉酶最适反应温度为70℃，在生产上高温可以增加淀粉的溶解性，而且能够显著减少杂菌的污染，对于食品安全以及淀粉加工业的工艺控制和成本降低都具有十分重要的意义。