甲基营养型菌株WGP35的筛选、鉴定及突变sdaA基因对其产L-丝氨酸的影响

摘要

甲基营养菌在自然界中的分布非常的广泛，它们具有独特的一碳代谢途径，能够将自然界中取之不尽的一碳化合物如甲醇、甲醛等转变为菌体自身所需的营养物质，同时又会产生多种有益的代谢副产物L-丝氨酸、维生素B12、聚β羟基丁酸盐等。因此，深入研究甲基营养菌具有重要的意义。
　　 L-丝氨酸是一种具有重要作用的氨基酸，被广泛应用于制药、食品、饲料、化妆品、农业等方面。全球每年L-丝氨酸的需求量很大，但L-丝氨酸的工业化生产却很难。目前主要利用微生物发酵法生产L-丝氨酸。
　　 本实验从不同的环境中筛选到三株不同的甲基营养型菌株WGP35、WGP07、WGM16。通过对菌株的16SrDNA序列分析、形态学观察及生理生化鉴定，将菌株WGP07归为副球菌(Paracoccus)，菌株WGM16归为甲基杆菌(Methylobacterium)，菌株WGP35归为假单胞菌(Pseudomonas)。三株菌都能够利用甲醇生产L-丝氨酸。其中菌株WGP35的L-丝氨酸产量最高为2.5mg/ml。
　　 sdaA基因编码的丝氨酸脱水酶(L-SerDH)催化L-丝氨酸降解为丙酮酸，是影响L-丝氨酸产量的关键因素。在本实验中突变菌株WGP35的sdaA基因，研究其对菌株产L-丝氨酸的影响。根据GenBank中PseudomonasputidaGB-1中的sdaA基因序列设计引物，PCR扩增sdaA的同源序列。测序结果发现与PseudomonasputidaGB-1中的sdaA基因序列在核苷酸水平上有90％的同源性。利用自杀质粒PK18mob对菌株WGP35中的sdaA基因进行定点突变，构建突变菌株WGP35TB。突变菌株WGP35TB表现为L-丝氨酸营养缺陷型。sdaA基因突变后突变菌株较野生菌株比其L-丝氨酸的产量提高了16％。