十字花科黑腐病菌全局调控蛋白RsmAxcc直接调控靶标的鉴定

摘要

Csr(Carbon Storage Regulator)/Rsm(Repressor of Secondary Metabolism)全局调控系统是一个由CsrA/RsmA蛋白和CsrB/RsmB，CsrC/RsmC等非编码RNA(noncoding RNA，也称small RNA)以及受CsrA/RsmA蛋白直接调控的mRNA组成的转录后调控系统。该系统广泛分布在各种细菌中，在细菌的碳代谢、次生代谢、运动性、生物膜形成以及一些病原菌的致病过程中发挥非常重要的作用。其调控机制在大肠杆菌(Escherichia coli)中研究得比较透彻。CsrA/RsmA蛋白是一类RNA结合蛋白，也是一个转录后调控子，它通过与靶标基因mRNA的特异性结合影响基因的翻译，同时它还是一个全局调控子，它参与各种与致病相关的许多细胞过程。在十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pathvar campestris，简称Xcc）中，CsrA/RsmA称为RsmAxc。小RNA是转录后全局调控的主要参与者，它通过与CsrA/RsmA的结合调节CsrA/RsmA的活性。
　　 目前，已经证实了在十字花科黑腐病菌中RsmAxc参与包括致病在内的多种细胞过程，但Xcc中Rsm全局调控系统的另两个重要组分——小RNA和mRNA——尚不清楚，为了深入了解RsmAxcc的作用机制，必须在Xcc中分离鉴定出与RsmAxc相互作用的小RNA和mRNA。
　　 本研究先采用共纯化法鉴定Xcc8004中与RsmAxc互作的小RNA和mRNA。在采取共纯化方法获取靶标的时候，我们构建出了能过量表达6×His RsmAxcc蛋白的黄单胞菌菌株。为了证明表达的蛋白具有生物学活性，我们将表达蛋白的融和质粒导入到rsmAxc缺失突变体菌株DM2506中，通过表型检测分析，我们发现质粒的导入使得DM2506缺失的表型得到回补。这说明我们说获得的6×His RsmAxc蛋白是有生物学活性的蛋白，可以用于下游的靶标鉴定实验中。在本实验中，我们共得到768个克隆，从中挑选出180个送测序公司测序，测序后得到168条序列，经序列比对后发现有15条序列能与Xcc 8004全基因组比对上，其中有5条是编码23S核糖体RNA的基因，有10条是编码tRNA的基因。结果表明，通过该方法，我们没有鉴定出Rsm全局调控系统中的sRNA和mRNA。
　　 另外，本研究还采用了靶标预测的方法鉴定RsmAxc的直接作用靶标。在十字花科黑腐病菌Xcc8004中，RsmAxc蛋白在转录后水平上直接调控着很多编码含有GGDEF/EAL结构域蛋白的基因。基于这一猜想，我们挑选出6个编码含有GGDEF/EAL结构域蛋白的基因：XC_0831、XC_1036、XC_1383、XC_1411、XC_2228、XC_2324作为受RsmAxc直接调控的候选靶标。经过电泳迁移率变动实验(electrophoresis mobility shif assay, EMSA)，我们初步确定出基因XC_2228可能在转录后水平上受RsmAxc蛋白的直接调控，但这一结果还需要进一步地确认。在后续的实验中，我们将对编码RsmAxc靶标mRNA的基因的功能进行分析，并检测RsmAxc对靶标mRNA稳定性的影响。