猪链球菌2型对氟喹诺酮类抗生素耐药性机制研究

摘要

猪链球菌病是当今世界养猪业的主要细菌传染病之一。最普遍的致病性血清型是2型，能引起猪的败血症、心内膜炎、脑膜炎、脓毒性关节炎、肺炎等，感染人类会引起败血症、心内膜炎和脑膜炎，严重会导致死亡。氟喹诺酮类药物是临床上广泛应用于治疗细菌感染的一类高效、广谱的人工化学合成药物，也是猪链球菌病的有效治疗药物之一，但是由于人医和兽医在临床上长期广泛使用以及不合理应用，其耐药性也随之产生并且逐渐增强。
　　 猪链球菌2型(SS2)对氟喹诺酮类药物的耐药机制很少有报道。为了探讨SS2耐氟喹诺酮类药物的机制，本研究对4株对诺氟沙星和恩诺沙星敏感的SS2进行诺氟沙星和恩诺沙星的耐药诱导，通过体外耐药诱导，将诺氟沙星和恩诺沙星的MIC提高至256μg/mL。通过研究亲本株和各自诱导至高度耐药菌株的DNA旋转酶(gyrA)和拓扑异构酶Ⅳ(parC)的氟喹诺酮类药物耐药决定区(QRDR)氨基酸变异情况、耐药菌株外排泵检测、耐药质粒的检测和消除、耐药质粒能否接合转移到大肠杆菌等方面探讨SS2耐氟喹诺酮类药物的机制。本试验还研究了耐不同氟喹诺酮类药物的SS2是否有交叉耐药性以及SS2在获得耐药性以后，其毒力和致病性是否会发生改变，为防治SS2提供理论依据。
　　 利用PCR方法从15株临床分离的猪链球菌菌株中扩增出6株为SS2，占分离总菌数的40％。通过微量稀释法测定了恩诺沙星和诺氟沙星对6株菌株的MIC，结果有4株对这两种药物敏感，2株耐药。
　　 采用体外递增药物浓度的方法对4株敏感株分别进行人工诱导产生恩诺沙星和诺氟沙星的耐药性，结果成功诱导出高度耐药菌株8株，两种药物对各自所诱导出来的菌株MIC为256μ g/mL。
　　 应用PCR方法对SS2敏感株和耐药株的gyrA和parC基因QRDR进行扩增、测序分析，结果发现75％的人工诱导耐药菌株(6/8)在parC的QRDR发生E83的突变，其他位点无共同性变化；在gyrA中，氨基酸的变化也无共同性，说明本试验诱导的耐药菌株，其药物作用靶基因的靶位突变不是细菌高度耐药的主要原因。
　　 检测耐药菌株质粒存在后，进行耐药质粒接合转移和消除试验。耐药质粒的接合转移试验结果显示，大肠杆菌DH5。没有获得SS2的耐氟喹诺酮类药物质粒；应用SDS.温度交替法对耐药菌株进行质粒消除后，耐药菌株对恩诺沙星和诺氟沙星的敏感性均有显著增加，对耐药质粒消除试验后的菌株进行质粒的提取，发现耐药菌株的质粒片段均有丢失。
　　 耐药菌株的交叉耐药性试验结果表明耐不同氟喹诺酮类药物的SS2之间存在着氟喹诺酮类药物的交叉耐药性。
　　 耐药菌株的外排泵初步检测试验结果显示，不同浓度的外排泵抑制剂氰氯苯腙(CCCP)分别与恩诺沙星、诺氟沙星联合应用后，都能显著恢复耐药菌株的药物敏感性。
　　 细菌毒力因子表型检测和小白鼠致病性试验结果显示，亲本株和各自诱导耐药菌株的毒力基因表型没有发生变化；对小白鼠的致病性也未发生改变，表明猪链球菌2型的毒力和致病性不会因为耐药性的产生而降低或加强。

目录

文摘

英文文摘

论文中涉及的主要英文缩写对照表

第一章 文献综述

1 猪链球菌2型简介

2 喹诺酮类药物

2.1 喹诺酮类药物的分类

2.2 氟喹诺酮类药物药动学特征

2.3 氟喹诺酮类药物的作用机制

3 猪链球菌对氟喹诺酮类抗生素的耐药机制

3.1 靶位变异

3.2 主动外排泵作用

3.3 质粒介导

4 猪链球菌对氟喹诺酮类抗生素耐药研究进展

5 控制和减少细菌耐药性问题的对策

5.1 合理使用抗生素

5.2 开发新的药物

6 本研究的目的意义

第二章 SS2的临床分离及鉴定

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 细菌的形态及培养特性

2.2 生化反应

2.3 猪链球菌2型的鉴定

3 讨论

3.1 猪链球菌2型的分离鉴定

3.2 猪链球菌2型的生化试验

第三章 人工体外诱导SS2对氟喹诺酮类药物耐药

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 恩诺沙星和诺氟沙星对6株菌株体外最小抑菌浓度(MIC)测定

2.2 人工体外诱导猪链球菌2型氟喹诺酮类药物耐药菌株

3 讨论

3.1 猪链球菌对氟喹诺酮类药物耐药情况和产生原因

3.2 药物浓度与细菌耐药性

第四章 SS2氟喹诺酮类药物耐药基因的扩增、克隆和测序

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 猪链球菌2型氟喹诺酮类药物耐药基因的PCR扩增

2.2 QRDR序列分析

3 讨论

第五章 SS2氟喹诺酮类药物耐药质粒的消除和接合转移试验

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 耐药质粒的检测和消除

2.2 耐药质粒接合转移

3 讨论

3.2 耐药质粒的消除

3.1 耐药质粒的接合转移

第六章 人工诱导SS2氟喹诺酮类药物耐药菌株交叉耐药性试验

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

3 讨论

第七章 人工诱导SS2氟喹诺酮类药物耐药菌株外排泵初步检测

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 CCCP对猪链球菌2型耐药菌株的MIC

2.2 CCCP对猪链球菌2型耐药菌株的影响

3 讨论

第八章 SS2的毒力和致病性试验

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 猪链球菌2型毒力因子PCR检测

2.2 致病性试验

3 讨论

3.1 我国猪链球菌2型毒力基因流行现状

3.2 猪链球菌耐药性与毒力之间的关系

第九章 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况