糖蜜酒精废液的厌氧生物处理及反应器中微生物群落结构分析

摘要

糖蜜酒精废液是一种高固体、高浓度、高酸性的深褐色有机废水，COD含量高，是糖厂的主要污染源之一。由于糖蜜酒精废液成分复杂，非常难以处理，给企业的经济效益和自然的环境效益造成了较大的压力。关于甘蔗糖蜜酒精废液的处理方法国内外已有较多的报道，目前认为最适宜的方法是厌氧生化处理，这也是一个沼气发酵的过程。利用宏基因组测序与分子生态学方法了解糖蜜酒精废液发酵过程的微生物群落结构，为利用微生物调控该类废水的处理提供依据。
　　 在实验室条件下建立以猪粪与糖蜜酒精废液为原料的共发酵模拟装置，发酵的有效容积为4L，发酵罐H1～H4的原料配比为猪粪与糖蜜酒精废液的质量体积比(w/v)分别为：1:0；1:0.5；1:1；1:1.5，每个比例设3个重复。发酵采用中温发酵工艺(37℃)，发酵的pH值范围为6.4～6.7。对发酵过程中发酵液理化性质与产气量进行检测分析，发现发酵前后，总C、总固体量、挥发性固体量、C/N比都有所下降，总N含量基本上保持不变。COD的去除率分别为68.7%，60.9%，56.4%和54.0%。
　　 用宏基因测序与变性凝胶电泳对各样品发酵前后的细菌群落的多样性进行分析，结果显示，发酵前后的细菌群落结构和多样性有很大的差异。发酵前期主要是一些将大分子物质降解成小分子物质的菌群，如：瘤胃球菌、毛螺旋菌、丙酸杆菌等作用比较活跃，其中普雷沃氏菌科是造成样品菌群差异最大贡献的物种。在发酵后期，主要是一些好氢微生物(主要是产甲烷菌)的存在，其中共养单胞菌科占有很高的比例。将发酵前后期的样品进行聚类分析发现，发酵前期与后期的菌种相似性差异比较大，但都在一定的区域范围内。
　　 为了更好的了解微生物对糖蜜酒精废液的生物作用，对工厂规模下的糖蜜酒精废液厌氧发酵罐中的微生物多样性进行分析。结果显示，与未添加糖蜜酒精废液的发酵罐相比，添加糖蜜酒精废液的发酵罐运行两个月后，微生物数量扩大了一倍，而且还存在一定量的拟杆菌科、肠杆菌科、乳杆菌科以及丙酸杆菌科，同时两者在菌群分布的比例上也存在较大的差异，其中共养单胞菌由原来的28.7%上升到38.6%，这些微生物可能在糖蜜酒精废水的处理过程中起着关键作用。

目录

文摘

英文文摘

第一章 前言

1.1 糖蜜酒精废液

1.1.1 酒精

1.1.2 糖蜜酒精废液

1.2 糖蜜酒精废液综合治理技术及进展

1.2.1 农田灌溉

1.2.2 浓缩处理

1.2.3 锅炉烟气处理法

1.2.4 废液的生化处理方案

1.2.5 以废治废处理方案

1.2.6 废水回用

1.2.7 共发酵

1.2.8 糖蜜酒精废液治理新技术...

1.3 沼气发酵原理

1.4 沼气发酵中的微生物

1.5 微生物群落多样性研究技术

1.5.1 传统分离培养方法

1.5.2 BIOLOG微平板法

1.5.3 微生物标记物法

1.5.4 微生物分子生态学

1.5 本研究的目的与意义

第二章 材料与方法

2.1 菌株和质粒

2.2 菌种保存

2.3 培养基、培养条件和抗生素

2.3.1 培养基

2.32 菌株培养条件

2.3.3 抗生素

2.4 主要仪器

2.5 总DNA的提取

2.6 DNA的电泳检测

2.7 DNA的回收纯化

2.8 细菌16S rDNA V3可变区DNA片段的扩增

2.9 古细菌16S rDNA片段的扩增

2.10 制备大肠杆菌感受态细胞(使用氯化钙法)

2.11 DNA的连接

2.12 质粒DNA的转化

2.13 DGGE方法

2.13.1 样品的制备

2.13.2 DGGE相关溶液的制备

2.13.3 DGGE凝胶的制备

2.13.4 上样及电泳

2.13.5 DGGE凝胶的染色方法

2.13.6 DGGE图谱的分析

2.13.7 DGGE条带回收及序列分析

2.14 沼气发酵装置的建立与样品的采集

2.14.1 发酵基质

2.14.2 沼气发酵装置

2.14.3 发酵条件

2.14.4 样品采集

2.15 气体产量的测定

2.16 甲烷含量的测定

2.17 发酵液pH值的测定

2.18 发酵原料总固体含量及挥发性固体含量的测定

2.19 总碳(TC)、总氮(TN)的测定

第三章 沼气发酵过程中产气规律及理化特性分析

3.1 实验室条件下发酵装备的建立

3.2 发酵过程中产沼气量的变化

3.3 发酵过程pH值的变化

3.4 发酵系统中TS、VS的变化

3.5 发酵过程中总N、总C以及C/N比的变化

3.6 发酵前后COD的变化

3.7 小结

第四章 糖蜜酒精废水厌氧发酵过程中微生物群落结构与多样性分析

4.1 微生物群落多样性分析

4.1.1 发酵样品宏基因组DNA的提取

4.1.2 细菌16S rDNA V3区的扩增

4.1.3 糖蜜酒精废水厌氧发酵过程中微生物多样性分析

4.2 工厂规模下糖蜜酒精废水厌氧发酵过程微生物多样性分析

4.2.1 发酵样品宏基因组DNA的提取和16s rDNA V3区的扩增

4.2.2 IC反应器中的细菌的多样性分析

4.2.3 IC反应器中的古细菌的多样性分析

4.3 小结

第五章 总结与讨论

5.1 沼气发酵过程中发酵液理化性质与产沼气情况的监测

5.2 沼气发酵过程中微生物多样性的分析

5.3 工厂模式下糖蜜酒精废水厌氧发酵过程微生物多样性分析

5.4 展望

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间发表论文情况