外源ABA提高甘蔗抗寒性的生理及分子机制研究

摘要

甘蔗是中国乃至世界第一大糖料作物，起源于热带及亚热带地区，属喜温作物。近年来，世界范围内极端天气频发，寒害、冻害增多，这给甘蔗生产造成了巨大的损失。在生产上，甘蔗防寒抗冻的措施主要有推广应用抗寒性好的品种、改善栽培管理措施及化学调控等。脱落酸(ABA)在植物的生长发育和抗逆胁迫生长中具有重要的作用。本研究采用土培和水培两种方式种植不同抗寒性的甘蔗品种GT28和YL6，在低温胁迫前12h用ABA进行处理，研究低温胁迫下ABA提高甘蔗抗寒性的生理生化机制，并利用荧光定量PCR技术、双向电泳和质谱分析技术，探讨ABA提高甘蔗抗寒性的分子机制。主要研究结果如下:
　　 1.低温胁迫下外源ABA对甘蔗幼苗生理生化特性的影响
　　 低温胁迫改变甘蔗幼苗叶片的生理生化特性。低温胁迫后，两个甘蔗品种幼苗叶片细胞膜透性增大;丙二醛(MDA)和脯氨酸含量增加;光合相关指标净光合速率（Pn）、气孔导度(Gs)和蒸腾速率（Tr）降低，而胞间CO2(Ci)则表现相反，浓度升高;叶绿素荧光指标最大光能转化效率(Fv/Fm)、光化学猝灭系数(qP)和PSⅡ实际量子效率(ΦPSⅡ)均降低，而初始荧光(Fo)和非光化学猝灭系数(NPQ)则升高;内源激素赤霉素(GA)和玉米素(ZR)含量下降，ABA含量升高，导致ABA/GA、ABA/IAA和ABA/ZR比值增大。低温胁迫下甘蔗幼苗脯氨酸、ABA和GA含量及ABA/GA比值存在基因型差异，抗寒性强品种脯氨酸、ABA含量和ABA/GA比值较高，GA含量较低，这是引起两个甘蔗品种不同抗寒性的重要生理基础。ABA处理后，有效缓解了低温胁迫对甘蔗的不利效应，使两个甘蔗品种幼苗叶片细胞膜、Pn、光系统Ⅱ、叶绿素含量相对稳定，降低了膜脂过氧化产物MDA和GA的含量，提高了脯氨酸、ABA含量和ABA/GA比值，从而提高两个甘蔗品种幼苗的抗寒性。
　　 2.低温胁迫下ABA及其合成抑制剂对甘蔗幼苗抗氧化酶活性的影响
　　 低温胁迫下，甘蔗幼苗抗氧化酶的活性提高。ABA处理的甘蔗幼苗ABA含量提高，抗氧化保护酶超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽还原酶(GR)的活性提高，活性氧自由基超氧阴离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)及膜脂过氧化产物MDA含量下降，而ABA合成抑制剂钨酸钠处理的结果则与之相反。这说明ABA及其合成抑制剂钨酸钠处理对低温胁迫下甘蔗幼苗抗氧化保护系统具有重要的调节作用。ABA对低温胁迫下甘蔗抗寒性的增强，可能与它对抗氧化保护系统的诱导密切相关。
　　 3.低温胁迫下ABA处理对甘蔗幼苗叶片蛋白质表达的影响
　　 低温胁迫影响甘蔗幼苗叶片蛋白质表达。利用蛋白质双向电泳分析，找出两个甘蔗品种低温胁迫和ABA处理下差异蛋白点48个，质谱成功鉴定其中29个。将它们按不同功能分为7类:①参与光合作用7个，占24.1％，包括光系统Ⅱ稳定因子、叶绿体a-b结合蛋白、铁氧还蛋白-NADP-氧化还原酶、核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶小亚基、光系统Ⅰ反应中心亚基、23 kD多肽光合系统Ⅱ、叶绿体Ptr-ToxA结合蛋白;②参与抵御胁迫保护酶7个，占24.1％，包括乙二醛酶、抗坏血酸过氧化物酶、硫氧还蛋白过氧化物酶、M型硫氧还蛋白、醌还原酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽硫转移酶;③参与蛋白加工6个，占20.7％，包括20 S蛋白酶体、30S核糖体蛋白、60 S酸性核糖体蛋白、FKBP型肽基脯氨酰顺反异构酶、BRⅡ-KD互作蛋白、肽基脯氨酰顺反异构酶;④参与基础代谢6个，占20.7％，包括谷草转氨酶、叶绿体醛缩酶、硫胺合成酶、磷酸丙糖异构酶、果糖-1，6-二磷酸醛缩酶前体、ATP合酶6亚基;⑤参与转录调控1个，占3.4％，为真核翻译起始因子5A;⑥参与细胞生长和分裂1个，占3.4％，为生长素结合蛋白;⑦未知功能蛋白1个，占3.4％，为假定蛋白。对其中10个编码差异蛋白质的基因mRNA的表达进行了分析，发现它们在转录水平与蛋白水平上的变化不一，相关性不高。进一步分析已鉴定蛋白的功能发现，低温胁迫通过蛋白质表达主要影响甘蔗了的光合作用和抗氧化保护系统，这也与生理参数的变化相符。ABA处理后，经过一系列蛋白的加工和折叠作用，稳定了光合系统，加强了抗氧化保护作用，从而提高植物抗寒性。
　　 4.抗寒相关基因的克隆与表达分析
　　 利用RT-PCR和RACE技术克隆了5个抗寒相关基因，获得了甘蔗抗坏血酸过氧化物酶基因cDNA全长1045 bp、甘蔗谷胱甘肽-S-转移酶基因cDNA全长912 bp、甘蔗ABA胁迫蛋白基因cDNA全长753 bp、甘蔗铁氧还蛋白-NADP还原酶基因cDNA全长为1335 bp及甘蔗脱水素基因cDNA全长578 bp。成功构建了这5个基因的原核表达载体，获得了它们在大肠杆菌中的融合表达蛋白。通过荧光定量PCR分析了SoAP、SoGST、SoASR、SoFNR和SoDHN的mRNA在转录水平的表达，结果表明两个甘蔗品种在对抗寒基因的表达调控上存在明显差异。SoAPX基因在抗寒性强的GT28中高表达时间长于抗寒性弱的YL6;SoGST基因在抗寒性强的GT28中启动要快于抗寒性弱的YL6;SoASR基因在抗寒性强的GT28中表达上调，并在胁迫1d时表达量最高，而在抗寒性弱的YL6中表达则下调;SoDHN基因在抗寒性强的GT28中增幅明显，最大增幅达到1200.6％，而在抗寒性弱的YL6中最大增幅仅为38.9％。可见低温胁迫下甘蔗抗寒相关基因表达的差异直接影响了基因型间的抗寒性。ABA处理后，这5个基因在两个甘蔗品种中都不同程度地被诱导，使得ABA信号的转导作用增强，甘蔗自身的抗氧化防护能力提高，膜的结构相对稳定，从而提高甘蔗抗寒性。可见，ABA对抗寒基因的诱导和调控，是其提高甘蔗抗寒性的重要分子基础。

目录

声明

摘要

英文缩略表1

英文缩略表2

1 文献综述

1．1 植物抗寒机理研究进展

1．1．1 植物抗寒的生理生化基础

1．1．2 植物抗寒的分子机制

1．2 ABA与植物抗寒性

1．2．1 ABA的生物合成

1．2．2 ABA与抗寒基因调控

1．2．3 外源ABA对植物抗寒性的影响

1．3 研究的背景

1．4 研究的目的意义

1．5 技术路线

2 低温胁迫下外源ABA对甘蔗幼苗生理生化特性的影响

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 材料种植与处理

2．1．3 测定项目与方法

2．1．4 数据分析

2．2 结果与分析

2．2．1 低温胁迫下外源ABA对甘蔗幼苗细胞膜透性的影响

2．2．2 低温胁迫下外源ABA对甘蔗幼苗MDA含量的影响

2．2．3 低温胁迫下外源ABA对甘蔗幼苗脯氨酸含量的影响

2．2．4 低温胁迫下外源ABA对甘蔗幼苗叶绿素含量的影响

2．2．5 低温胁迫下外源ABA对甘蔗幼苗光合性能的影响

2．2．6 低温胁迫下外源ABA对甘蔗幼苗叶绿素荧光参数的影响

2．2．7 低温胁迫下外源ABA对甘蔗幼苗内源激素含量的影响

2．3 讨论

2．3．1 低温胁迫对甘蔗细胞膜和渗透调节的影响与ABA调控

2．3．2 低温胁迫对甘蔗光合性能的影响与ABA调控

2．3．3 低温胁迫对甘蔗叶绿素荧光参数的影响与ABA调控

2．3．4 低温胁迫对甘蔗内源激素含量的影响与ABA调控

2．4 小结

3 低温胁迫下ABA及其合成抑制剂对甘蔗幼苗抗氧化酶活性的影响

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 甘蔗培养及取样

3．1．3 测定项目与方法

3．1．4 数据分析

3．2 结果与分析

3．2．1 低温胁迫下ABA及其抑制剂对甘蔗幼苗ABA含量的影响

3．2．2 低温胁迫下ABA及其抑制剂对甘蔗幼苗MDA含量的影响

3．2．3 低温胁迫下ABA及其抑制剂对甘蔗幼苗O2ˉ产生速率的影响

3．2．4 低温胁迫下ABA及其抑制剂对甘蔗幼苗H2O2含量的影响

3．2．5 低温胁迫下ABA及其抑制剂对甘蔗幼苗CAT活性的影响

3．2．6 低温胁迫下ABA及其抑制剂对甘蔗幼苗POD活性的影响

3．2．7 低温胁迫下ABA及其抑制剂对甘蔗幼苗SOD活性的影响

3．2．8 低温胁迫下ABA及其抑制剂对甘蔗幼苗APX活性的影响

3．2．9 低温胁迫下ABA及其抑制剂对甘蔗幼苗GR活性的影响

3．3 讨论

3．4 小结

4 低温胁迫下ABA处理对甘蔗幼苗叶片蛋白质表达的影响

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 材料处理与采样

4．1．3 主要生化试剂

4．1．4 主要仪器设备

4．1．5 相关溶液的配置

4．1．6 样品蛋白质的提取

4．1．7 蛋白的溶解及其含量测定

4．1．8 双向凝胶电泳

4．1．9 染色

4．1．10 图像扫描及分析

4．1．11 差异蛋白点质谱鉴定及生物信息学分析

4．1．12 RNA提取和荧光定量PCR

4．2 结果与分析

4．2．1 低温处理7 d时甘蔗叶片总蛋白质的SDS-PAGE图谱

4．2．2 低温胁迫下ABA对甘蔗幼苗蛋白质表达的影响

4．2．3 差异表达蛋白MALDI-TOF-TOF／MS鉴定

4．2．4 差异表达蛋白的荧光定量PCR分析

4．3 讨论

4．3．1 参与光合作用相关蛋白

4．3．2 参与抵御胁迫相关蛋白

4．3．3 参与蛋白加工相关蛋白

4．3．4 参与代谢的相关蛋白

4．3．5 参与转录调控相关蛋白

4．4 小结

5 抗寒相关基因的克隆与表达分析

5．1 材料与方法

5．1．1 试验材料

5．1．2 主要试剂

5．1．3 主要仪器

5．1．4 总RNA提取和cDNA合成

5．1．5 基因cDNA全长获得

5．1．6 序列分析

5．1．7 基因的实时荧光定量表达分析

5．1．8 基因的原核表达

5．2 结果与分析

5．2．1 甘蔗叶片总RNA及cDNA质量

5．2．2 甘蔗抗寒相关基因cDNA全长的克隆及序列分析

5．2．3 基因原核表达载体构建及原核表达

5．2．4 甘蔗抗寒相关基因在低温胁迫下的表达分析

5．3 讨论

5．3．1 SoAPX基因在甘蔗低温胁迫和ABA处理中的作用

5．3．2 SoGST基因在甘蔗低温胁迫和ABA处理中的作用

5．3．3 SoASR基因在甘蔗低温胁迫和ABA处理中的作用

5．3．4 SoFNR基因在甘蔗低温胁迫和ABA处理中的作用

5．3．5 SoDHN基因在甘蔗低温胁迫和ABA处理中的作用

5．4 小结

6 结论

6．1 全文总结

6．2 论文创新点

6．3 问题与展望

致谢

参考文献

附录 作者在攻读博士学位期间科研、学术活动、论文发表和专利发明等情况