IBV分离株GX-YL5感染对鸡气管黏膜和哈德氏腺免疫功能影响的研究

摘要

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)是由冠状病毒鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起的一种急性高度接触传染性呼吸道疾病，给养禽业带来严重的经济损失。IBV是典型的嗜黏膜病原，主要通过呼吸道黏膜途径感染机体。黏膜免疫可诱导局部黏膜免疫和诱导全身免疫，在抗IBV感染免疫应答中发挥非常重要的作用。禽类的气管黏膜和哈德氏腺是黏膜免疫系统的重要组成部分，因此研究IBV感染对气管黏膜和哈德氏腺免疫功能的影响非常重要。
　　 本研究采用IBV广西分离株GX-YL5人工感染免疫鸡和非免疫鸡，应用实时荧光定量RT-PCR方法检测不同时相气管黏膜和哈德氏腺中与天然免疫相关的部分模式识别受体（TLR2、TLR3、TLR6和TLR7）和细胞因子(IFN-α、IFN-β、Mx、IL-6、IL-10、IL-1β、MMP3、MIP-1β、CXCR4和CCR6)的mRNA转录水平与IBV病毒载量动态，同时使用ELISA检测气管黏膜和哈德氏腺分泌型免疫球蛋白A(sIgA)和血清IgG抗体，旨在从分子水平探究IBV对鸡气管黏膜和哈德氏腺免疫功能的影响，为阐明IBV的分子致病机制奠定基础。
　　 实验结果显示:在感染早期（14DPI前），攻毒组和免疫攻毒组气管黏膜和哈德氏腺TLR2、TLR3、TLR6和TLR7的mRNA表达水平在大部分时间点都出现了不同程度的上调，气管黏膜TLR2、TLR3、TLR6和TLR7整体上比同组哈德氏腺上调表达明显。攻毒14天后，攻毒组和免疫攻毒组哈德氏腺与气管黏膜所检测TLRs表达水平已逐渐下调或恢复正常水平。揭示气管黏膜和哈德氏腺TLR2、TLR3、TLR6和TLR7参与了IBV感染早期的免疫应答，表明了IBV感染对宿主的天然免疫应答具有明显影响。
　　 在感染早期（14DPI前），攻毒组气管黏膜IFN-β、IL-6、IL-10、IL-1β、CXCR4、CCR6和MMP3比同组哈德氏腺相同基因表达上调更明显;免疫攻毒组气管黏膜IFN-α、IFN-β、Mx、IL-6、IL-10、IL-1β和CCR6比同组哈德氏腺相同基因上调表达明显;攻毒组气管黏膜Mx(8DPI前)、IFN-β(3DPI)和IL-10(5DPI)比免疫攻毒组气管黏膜相同基因上调更显著;攻毒组哈德氏腺Mx(1DPI)、IFN-β(8DPI)、IL-10(5DPI)和CCR6(1DPI)与免疫攻毒组哈德氏腺相同基因表达差异明显。攻毒14天后，上述细胞因子在攻毒组和免疫攻毒组哈德氏腺与气管黏膜表达水平已逐渐下调或恢复正常水平，表明了IBV感染早期多种细胞因子参与了抗IBV感染免疫应答，但对IBV感染的免疫应答程度因细胞类型及宿主免疫状态差异而不同。
　　 攻毒组和免疫攻毒组气管黏膜病毒载量分别在攻毒后3天和攻毒后5天达到峰值，攻毒组和免疫攻毒组哈德氏腺病毒载量均在攻毒后3天达到峰值，攻毒组和免疫攻毒组气管黏膜和哈德氏腺在攻毒后1天至8天都保持较高的病毒载量，随后随时间的推移病毒含量逐渐减少。整体上攻毒组气管黏膜和哈德氏腺比免疫攻毒组相同组织的病毒载量高，攻毒组和免疫攻毒组哈德氏腺病毒载量消长情况与它们的气管黏膜病毒载量变化趋势基本呈正相关性。结果证实了IBV GX-YL5可在气管黏膜和哈德氏腺中复制，感染鸡气管黏膜和哈德氏腺病毒载量与鸡的临床表现存在时间相关性。同时，感染鸡气管黏膜和哈德氏腺病毒载量和相应组织的TLRs和细胞因子mRNA表达水平整体上也呈现一定的相关性。
　　 在所检测时间点中，只发现攻毒组气管洗液sIgA在5DPI和8DPI、免疫攻毒组气管洗液sIgA在8DPI，与哈德氏腺sIgA在1DPI与5DPI出现显著上调(P＜0.05)外，其它时间点与对照组相比差异均不显著。免疫攻毒组血液中特异性IgG抗体产生非常迅速，在攻毒后3天抗体水平就开始明显升高，直到攻毒后14天达到高峰，在攻毒后28天仍维持较高的抗体水平;攻毒组在攻毒后5天才出现抗体升高的趋势，在攻毒后14天达到高峰，同样至攻毒后28天仍维持较高的抗体水平。结果提示IBV GX-YL5刺激鸡体气管黏膜和哈德氏腺产生少量sIgA，而刺激机体血液产生大量IgG抗体，引发全身性体液免疫，免疫攻毒组比非免疫攻毒组在感染早期血液中产生IgG的速度更快。
　　 综合研究结果表明，感染早期，IBV激活了机体气管黏膜和哈德氏腺TLR信号通路，对天然免疫应答产生明显的影响，刺激产生(I)型干扰素、炎性细胞因子和趋化因子，起始获得性免疫共同抵抗病毒的感染，将病毒快速从局部感染部位清除。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1．1 鸡传染性支气管炎病毒天然免疫研究概况

1．1．1 传染性支气管炎病毒

1．1．2 天然免疫

1．1．3 IBV感染的天然免疫应答研究进展

1．2 家禽黏膜免疫

1．2．1 家禽呼吸道黏膜免疫

1．2．2 家禽的哈德氏腺

1．2．3 鸡分泌型免疫球蛋白A

1．3 实时荧光定量PCR

1．3．1 实时荧光定量PCR原理

1．3．2 实时荧光定量PCR定量方法

1．3．3 实时荧光定量PCR的应用

1．4 本课题的研究目的和意义

第二章 IBV GX-YL5感染对鸡气管黏膜和哈德氏腺TLR2、TLR3、TLR6和TLR7 mRNA转录水平的影响

2．1 材料

2．1．1 实验动物和病毒

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 动物分组和攻毒

2．2．2 实验动物样品的采集和处理

2．2．3 RNA的抽提

2．2．4 RNA质量和浓度检测

2．2．5 反转录

2．2．6 Real-time PCR反应

2．2．7 数据统计和分析

2．3 结果

2．3．1 临床症状和剖检病理变化

2．3．2 RNA质量和浓度检测结果

2．3．3 气管黏膜和哈德氏腺TLR2、TLR3、TLR6和TLR7 mRNA转录水平

2．4 小结与讨论

第三章 IBV GX-YL5感染对鸡气管黏膜和哈德氏腺部分细胞因子mRNA转录水平的影响

3．1 材料

3．1．1 实验动物和病毒

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器

3．2 方法

3．2．1 动物实验

3．2．2 实验动物样品的采集和处理

3．2．3 RNA的抽提

3．2．4 RNA质量和浓度检测

3．2．5 反转录

3．2．6 Real-time PCR反应

3．2．7 数据统计和分析

3．3 结果

3．3．1 气管黏膜和哈德氏腺细胞因子mRNA转录水平

3．4 小结与讨论

第四章 IBV GX-YL5感染鸡后不同时相气管黏膜和哈德氏腺IBV载量的变化动态

4．1 材料

4．1．1 实验动物和病毒

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要仪器

4．2 方法

4．2．1 动物实验

4．2．2 实验动物样品的采集和处理

4．2．3 RNA的抽提

4．2．4 RNA质量和浓度检测

4．2．5 反转录

4．2．6 Real-time PCR反应

4．2．7 数据统计和分析

4．3 结果

4．3．1 IBV感染鸡后气管黏膜和哈德氏腺病毒载量变化情况

4．4 小结与讨论

第五章IBV GX-YL5感染鸡后不同时相气管洗液与哈德氏腺sIgA抗体和血清IgG抗体变化情况

5．1 材料

5．1．1 实验动物和病毒

5．1．2 主要试剂及配制

5．1．3 主要仪器

5．2 方法

5．2．1 动物实验

5．2．2 实验动物样品的采集和处理

5．2．3 sIgA抗体的检测

5．2．4 血清IgG抗体的检测

5．2．5 数据统计和分析

5．3 结果

5．3．1 攻毒后不同时相气管洗液sIgA浓度

5．3．2 攻毒后不同时相哈德氏腺sIgA浓度

5．3．3 攻毒后不同时相血清IgG抗体水平

5．4 小结与讨论

第六章 结论

参考文献

致谢

附录

个人简历

攻读学位期间发表论文情况及参加科研项目