OsTFL2基因在水稻开花调控网络中的定位研究及OsMED32基因干扰载体的构建

摘要

植物开花受到遗传途径、环境因素以及植物育种状态的综合调控，其中开花诱导是开花植物生殖生长启动的第一步，也是基因间相互作用最复杂的一个过程。水稻开花涉及很多基因，且这些基因间又相互作用，从而形成调控水稻开花的网络。本研究利用原位杂交实验技术揭示了在OsTFL2RNAi背景下水稻中开花调控基因的表达模式和表达量的变化，来寻找OsTFL2的物理学/遗传学下游基因。
　　 通过对水稻不同品种DNA和CDS的序列分析得知，不同水稻品种OsTFL2DNA的序列同样具有保守性，但Os TFL2序列的高保守性并不等同于性状的高保守性;在水稻中同样存在序列的“插入和缺失”，加之不同水稻品种DNA和CDS之间的分歧，推测在细胞减数分裂时发生的不等交换以及RNA加工去除内含子这两个过程是OsTFL2基因变异的主要来源，而OsTFL2RNA加工和功能表现型则可能同时也受到遗传背景的调控，在不同水稻品种中有不同的开花机理，OsTFL2促进开花这一功能因品种的不同而存在差别，探索OsTFL2基因在水稻开花诱导和花发育过程中的如何发挥作用。
　　 Mediator complex subunit32(MED32)和哺乳类中的MED29以及酵母中的MED2属于同源基因，OsMED32蛋白是Mediator complex尾端的一部分且是DNA结合转录因子。本试验中所研究的OsMED32利用RNAi技术，构建OsMED32过表达和干扰表达载体并转化至农杆菌中，使OsMED32在水稻中过量表达及表达沉默，从而探索OsMED32的基因功能，可以进一步探索OsMED32蛋白对OsTFL2转录表达的调控作用。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 拟南芥开花调控机理

1．2 水稻开花调控网络机理

1．3 植物TFL2基因的功能

1．3．1 拟南芥AtTFL2基因的功能

1．3．2 水稻OsTFL2基因的功能

1．4 MED蛋白的研究进展

1．5 RNAi技术在本研究中的应用

1．6 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 水稻TFL2RNAi背景下开花基因的RNA原位杂交

2．1．1 实验材料

2．1．2 质粒与分子生物学试剂

2．1．3 材料固定

2．1．4 脱水

2．1．5 透明

2．1．6 透蜡

2．1．7 包埋

2．1．8 切片

2．1．9 原位杂交RNA探针的制备

2．1．10 切片的预处理

2．1．11 预杂交与杂交

2．1．12 洗涤

2．1．13 检测杂交信号

2．2 水稻Hd3a在TFL2RNAi背景下的半定量RT-PCR

2．2．1 实验材料

2．2．2 主要分子生物学试剂

2．2．3 提取水稻总RNA

2．2．4 反转录合成cDNA

2．2．5 水稻Hd3a在TFL2RNAi背景下的半定量RT-PCR

2．3 OsTFL2 DNA和cDNA的序列分析

2．3．1 水稻OsTFL2 DNA和cDNA序列的来源

2．3．2 序列分析方法

2．4 OsMED32表达载体的构建

2．4．1 材料

2．4．2 质粒载体与分子生物学试剂

2．4．3 引物

2．4．4 水稻基因组DNA的提取

2．4．5 制备大肠杆菌DH5a感受态细胞(CaCl2法)

2．4．6 OsMED32 Overexpress(OsMED32 OE)表达载体的构建

2．4．7 OsMED32干扰载体构建

2．4．8 植物表达载体向农杆菌中转化

3 结果与分析

3．1 水稻TFL2RNAi背景下开花基因的RNA原位杂交结果与分析

3．2 TFL2RNAi背景下Hd3a的半定量RT-PCR结果分析

3．2．1 水稻总RNA和cDNA

3．2．2 水稻Hd3a半定量RT-PCR分析

3．3 OsTFL2 DNA和cDNA序列的比对分析

3．4 OsMED32表达载体的构建

3．4．1 OsMED32OE表达载体的构建

3．4．2 OsMED32 RNAi表达载体的构建

3．4．3 农杆菌中过表达载体的菌液PCR鉴定

3．4．4 农杆菌中干扰表达载体的菌液PCR鉴定

4 讨论

4．1 RNA原位杂交技术的重要性

4．2 OsTFL2与水稻开花基因之间的调控关系

4．3 应用RNA干扰技术研究水稻开花基因功能

4．4 RNA沉默效率

4．5 OsTFL2 DNA和cDNA序列的保守性与趋异性

4．5．1 OsTFL2 DNA和cDNA序列的保守性

4．5．2 OsTFL2 DNA和cDNA序列的趋异性

4．6 MED蛋白在植物中的调控作用

5 结论

致谢

参考文献

附录A：本研究中部分载体图谱

附录B：本研究中用到的部分试剂

附录C：攻读学位期间参与的科研项目及发表的论文