甘蔗乙烯受体基因SoERS1表达、转化及启动子序列的研究

摘要

甘蔗为重要的糖料作物和经济作物，通过培育新品种，结合栽培技术来提高甘蔗糖分、产量、抗逆性，是甘蔗糖业的主要发展方向。乙烯在植物生长发育过程中具有重要调节作用，对乙烯信号转导途径及其相关基因已有不少研究，获得了多个受体基因，但对受体基因调控机理尚未清楚。乙烯利能够显著提高甘蔗的产量、蔗糖分、抗逆性，但其作用分子机理也未明确。因此，本实验以新台糖22号为材料，进行了甘蔗乙烯受体基因SoERS1表达、遗传转化和启动子序列研究。主要结果如下:
　　 1.SoERS1表达分析。在伸长期和工艺成熟期，叶片中SoERS1基因的表达为成熟叶＞幼叶＞老叶。在蔗茎中，老茎的表达量大于幼茎和成熟茎，伸长期成熟茎大于幼茎，而工艺成熟期成熟茎低于幼茎。在生理成熟期甘蔗不同组织部均能检测到SoERS1基因的表达，说明该基因可能为组成型表达模式。干旱胁迫和黑暗条件下可以抑制成熟叶中SoERS1基因的表达;100 mg/L乙烯利处理伸长期甘蔗，成熟叶中SoERS1在第1d基因表达量急剧升高。在苗期进行6℃低温胁迫，叶中SoERS1的表达先降后升，低温胁迫后恢复生长2d，基因的表达回升。
　　 2.植物表达载体构建。根据本课题组前期从新台糖20号(ROC20)中克隆出甘蔗乙烯受体基因(GQ369007)序列，在其编码区设计特异引物，并从新台糖22号(ROC22)中克隆到ERS基因完整编码框序列，基因命名SoERS1。在上、下游引物分别加XbaⅠ和SmaⅠ酶切位点，构建SoERS1正义表达载体pBIERS。利用软件SiRNATarget Finder预测和分析SoERS1基因siRNA干扰片段，最终选定编码区前403 bp，将该片段分别正向、反向插入中间载体176中，再用EcoRⅠ、HindⅢ双酶切中间载体176，将目的片段切下连接到表达载体pCAMBIA1300上，把目的基因连接到pCAMBIA1300，构建了RNAi干扰载体p1300ERS。
　　 3.SoERS1遗传转化和原核表达。通过农杆菌介导法，把pBIERS转入烟草k346，PCR检测目的片段与载体GFP基因序列，确认甘蔗SoERS1基因已经整合到烟草基因组DNA中，转化效率为61％。对苗期转基因烟草喷施200 mg/L的乙烯利可以提高烟草叶片的乙烯释放速率。
　　 构建的非融合原核表达载体pETERS1和融合原核表达载体pETERS2在原核菌株BL21(DE3)和Rosetta(DE3)均不能表达，这可能与该基因序列中稀有密码子含量较高，或酶蛋白自身某些特性不适合在原核细胞里表达有关。
　　 4.SoERS1启动子序列克隆和分析。采用基于热不对称交错式PCR原理的染色体步移技术，克隆甘蔗SoERS1基因上游启动子序列，得到位于翻译起始密码子ATG之前的序列1410bp，在GeneBank登录号为KC862312。该序列与玉米ERS25和玉米ERS14核苷酸同源性分别为82％和80％。利用PlantCARE和PLACE在线预测该启动子序列，发现该序列除了含有启动子基本作用元件CAAT-box和TATA-box之外，还含有多个特异的调控元件，如参与光响应元件、干旱诱导MYB结合位点、茉莉酸甲酯响应元件、水杨酸响应元件、胚乳表达顺式调控元件、热胁迫响应元件等，推测SoERS1基因的表达可能受生理周期、激素、干旱、光照等因素调控。

目录

声明

摘要

英文缩略表

1 前言

1．1 乙烯的作用

1．1．1 乙烯信号转导途径

1．1．2 乙烯信号转导的调控因子

1．2 乙烯受体基因的分类

1．3 乙烯受体蛋白结构

1．3．1 氨基端的跨膜结构

1．3．2 GAP结构域

1．3．3 组氨酸激酶结构域

1．4 乙烯受体基因的表达

1．4．1 乙烯受体基因的组织特异性表达

1．4．2 环境胁迫对乙烯受体基因的表达影响

1．4．3 激素和抑制剂对乙烯受体基因的表达影响

1．5 乙烯受体基因的遗传转化

1．6 基因启动子

1．7 本研究的目的和内容

2 甘蔗乙烯受体SoERS1基因表达分析

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 试剂和主要仪器

2．1．3 方法

2．2 结果与分析

2．2．1 RNA琼脂糖凝胶电泳检测

2．2．2 甘蔗SoERS1的组织特异性表达

2．3 讨论

3 甘蔗SoERS1植物表达载体的构建及转化烟草

3．1 材料

3．1．1 试验材料

3．1．2 菌种与质粒

3．1．3 酶与试剂

3．2 方法

3．2．1 SoERS1编码区的克隆

3．2．2 甘蔗SoERS1基因正义表达载体的构建

3．2．3 SoERS1基因RNAi植物表达载体的构建

3．2．4 农杆菌介导SoERS1正义基因遗传转化烟草

3．3 结果与分析

3．3．1 SoERS1编码区克隆结果

3．3．2 正义植物表达载体构建

3．3．3 RNAi植物表达载体的构建

3．3．4 根癌农杆菌的转化与鉴定

3．4 讨论

4 甘蔗乙烯受体SoERS1基因原核表达分析

4．1 材料

4．1．1 菌株和质粒

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要仪器设备

4．2 方法

4．2．1 试剂的配制

4．2．2 甘蔗SoERS1基因大肠杆菌表达载体的构建

4．2．3 甘蔗SoERS1基因在大肠杆菌Rosetta(DE3)中的表达

4．2．4 SDS-PAGE电泳检测

4．3 结果与分析

4．3．1 PCR产物的鉴定

4．3．2 甘蔗SoERS1基因的序列比对

4．3．3 甘蔗SoERS1基因原核表达载体的验证与分析

4．3．4 pET-ERS1、pET-ERS2在大肠杆菌Rosetta(DE3)中的表达情况

4．4 讨论

4．4．1 载体和菌株对基因表达的影响

4．4．2 体外表达系统

5 甘蔗SoERS1启动子序列的克隆和序列分析

5．1 材料与方法

5．1．1 试剂

5．1．2 甘蔗DNA的提取

5．1．3 引物设计

5．1．4 甘蔗SoERS1基因启动子序列的克隆

5．2 结果与分析

5．2．1 DNA琼脂糖凝胶电泳检测

5．2．2 甘蔗SoERS1启动子序列克隆

5．2．3 甘蔗SoERS1启动子同源性分析

5．2．4 甘蔗SoERS1启动子作用元件分析

5．3 讨论

6 全文结论与展望

6．1 全文结论

6．1．1 甘蔗SoERS1的表达分析

6．1．2 甘蔗SoERS1表达载体的构建和遗传转化

6．1．3 甘蔗SoERS1原核表达结果分析

6．1．4 甘蔗SoERS1基因启动序列克隆和分析

6．2 问题与展望

致谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间学术活动和论文发表等情况