十字花科黑腐病菌中GGDEF结构域蛋白基因XC0831的功能研究

摘要

GGDEF结构域因其活性中心保守的Gly-Gly-Asp-Glu-Phe氨基酸残基序列而得名。多数具有GGDEF结构域的蛋白都具有二鸟苷酸环化酶(DGC)活性，催化两分子GTP合成环二鸟苷单磷酸(c-di-GMP)。第二信使c-di-GMP在很多细菌特别是病原菌中参与调控多种受群体感应(QS)调控的细胞反应。十字花科黑腐病菌(Xcc)是十字花科植物黑腐病的病原菌，是研究微生物与寄主相互作用分子机理的模式菌株之一。Xcc8004中有32个基因编码含GGDEF结构域蛋白，部分GGDEF结构域蛋白与Xcc致病性、胞外酶产生、生物膜形成和运动能力等相关。XC0831是Xcc8004中编码含GGDEF结构域蛋白的第二大基因。在先前的工作中，本实验室已构建出XC0831的非极性整合突变体NK0831和Tn5插入突变体，两者致病力与野生型相比均明显下降，但其他表型如生物膜、絮凝、游动性等有较大差异。为了更准确的分析该基因的功能，本研究构建了XC0831的缺失突变体DM0831和结构域缺失突变体:DMSP、DMGGDEF。实验结果显示，DM0831突变体的致病力和运动能力较野生型Xcc8004明显下降，且胞外蛋白酶产量升高，在MMX培养基中生长速度降低，吸附能力增强。DMSP仅胞外纤维素酶产量降低，DMGGDEF的胞外蛋白酶产量高于野生型。本研究构建了DM0831的反式功能互补菌株和过表达菌株（分别采用pLAFR6和pLAFR3两种不同质粒）。在DM0831中导入含有不同结构域（标记为A、C、D）的片段的pLAFR3质粒，根据表型分析对应结构域的功能。DM0831中导入pL6-0831质粒后其多种生理生化表型基本得到恢复，如蛋白酶产量降低、运动能力增强、吸附能力减弱至野生型状态，但未恢复DM0831的致病力。NK0831、WT8004/pL3-0831、DM0831/pL3-0831的致病力均降低，其中DM0831/pL3-0831的致病力仅为野生型8004菌株致病力的5％左右。另外，三种菌株的胞外淀粉酶、胞外纤维素酶、EPS产量和运动能力降低，但其胞外蛋白酶产量和吸附能力升高，在LB培养基中摇瓶培养可以产生絮凝，这与胞内c-di-GMP水平高于正常水平时的表型一致。以此推测XC0831的过表达菌株胞内c-di-GMP水平提高。与DM0831相比，DM0831/pL3-A运动能力提高，而DM0831/pL3-C的运动能力降低，且两者在LB培养基中摇瓶培养均产生絮凝。DM0831/pL3-D较DM0831在各表型上均无明显变化。对比分析DM2252和Xcc8004的转录组结果，发现在MMX培养基中，XC2252对XC0831的表达有负调控作用。本研究构建了XC0831基因表达GUS报告子并分别导入WT8004和DM2252，定量检测GUS活性发现在DM2252中XC0831的表达量高于其在Xcc8004中的表达，这与转录组结果基本相符。另构建了DM2252/DM0831双缺失突变体，DM2252在LB培养基中摇瓶培养情况下可以产生絮凝，而DM2252/DM0831不能产生絮凝。说明DM2252可以产生絮凝可能是由于其菌株内XC0831的表达量增加起到主要作用。本研究通过对XC0831各功能区域的功能鉴定和分析，和vemR对其调控关系的鉴定与分析，研究其调控生物膜形成的机制，为更好的解释细菌调控生物膜形成与解离的机制提供更多证据。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 十字花科黑腐病菌概述

1．1．1 十字花科黑腐病菌简介

1．1．2 十字花科黑腐病菌致病因子及相关基因

1．2 十字花科黑腐病菌致病相关调控基因

1．2．1 Hrp／T3SS系统调控相关基因

1．2．2 双组分调控系统与群体感应系统相关基因

1．2．3 Xcc中其他致病相关调控基因和复杂的调控网络

1．3 GGDEF结构域和XC0831研究进展

1．3．1 GGDEF结构域蛋白研究进展

1．3．2 XC0831研究进展

1．3．3 Reg_prop结构域研究进展

1．4 c-di-GMP生物学功能及其调控

1．4．1 c-di-GMP代谢与代谢调控

1．4．2 c-di-GMP下游靶标

1．4．3 受c-di-GMP调控的细胞功能

1．5 本研究的主要目的、内容和意义

第二章 材料方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株与质粒

2．1．2 引物

2．1．3 抗生素

2．1．4 菌株培养及保藏

2．1．5 常用试剂及缓冲液

2．2 DNA分子操作技术

2．2．1 Xcc总DNA提取

2．2．2 质粒DNA提取(碱裂解法)

2．2．3 DNA纯化

2．2．4 琼脂糖凝胶电泳

2．2．5 DNA酌切

2．2．6 DNA连接

2．2．7 PCR反应

2．2．8 DNA转化

2．2．9 三亲本结合

2．3 突变体和互补株的生理生化检测

2．3．1 胞外多糖(EPS)的检测

2．3．2 胞外淀粉酶检测

2．3．3 胞外纤维素酶检测

2．3．4 胞外蛋白酶检测

2．3．5 菌株运动能力检测

2．3．6 生物膜检测实验

2．3．7 菌株吸附能力检测

2．3．8 絮凝检测实验

2．3．9 基本培养基平板检测

2．3．10 基本培养基中生长曲线测定

2．4 植株实验

2．4．1 致病力检测

2．4．2 过敏反应实验

2．5 β-葡糖苷酸酶(GUS)活性检测

2．5．1 定性检测

2．5．2 定量检测

第三章 XC0831及各功能区域功能研究

3．1 XC0831基因的生物信息学分析

3．1．1 XC0831基因的基本信息及编码产物的结构域分析

3．1．2 非极性突变体NK0831的生物信息学分析

3．1．3 Xcc 8004中与XC0831结构域相似基因的结构域分析

3．2 缺失突变体的构建

3．2．1 重组质粒的构建与验证

3．2．2 三亲结合实验及缺失突变体的筛选验证

3．3 反式互补菌株及过量表达菌株的构建

3．3．1 重组质粒的构建

3．3．2 三亲结合实验及互补株的筛选验证

3．4 不同结构域互补株的构建

3．4．1 不同结构域互补重组质粒的构建

3．4．2 三亲结合实验及结构域互补株的筛选验证

3．5 突变体及互补株的表型检测与分析

3．5．1 突变体及互补株在基本培养基上的生长情况检测

3．5．2 突变体及互补株致病力和HR检测

3．5．3 突变体及互补菌株胞外酶、EPS产量的平板检测

3．5．4 突变体及互补菌株的运动能力检测

3．5．5 突变体及互补菌株生物膜形成及吸附能力检测

3．5．6 突变体及互补菌株絮凝检测

第四章 XC2252与XC0831调控关系研究

4．1 引言

4．2 XC2252对XC0831负调控作用的GUS报告基因验证

4．2．1 XC0831 GUS报告子构建与导入

4．2．2 GUS报告基因表达活性测定与分析

4．3 双缺失突变体的构建及表型检测

4．3．1 XC0831和XC2252双突变株构建

4．3．2 双缺失突变菌株表型检测与分析

第五章 结论与讨论

5．1 结论

5．2 讨论

5．2．1 NK0831与XC0831过量表达菌株表型相似

5．2．2 XC0831与细胞内c-di-GMP水平关系

5．2．3 XC0831不同结构域可能行使不同功能

5．2．4 XC0831与vemR调控网络

5．3 后续工作

参考文献

致谢

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