聚-β-羟基丁酸酯高产菌株的选育及发酵条件优化的初步研究

摘要

由于石油资源的日益枯竭及其塑料制品对环境造成了日益严重的“白色污染”，因此，加快研究和开发可降解的环境友好型塑料，实现工艺上的突破，实现可降解塑料的产业化和实用化，对于防治环境污染和实现可持续发展具有重要的现实意义。聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一种微生物在碳氮失衡的情况下产生的一种塑料，是三大生物降解塑料（淀粉基塑料、聚乳酸、PHA）之一，聚-β-羟基丁酸酯(PHB)作为PHA家族的一份子，一直是研究的重点和热点。本实验从南宁等地区采集的样品中筛选PHB高产菌株，通过尼罗蓝染色法筛选出菌株CK-5，PHB产量为3.4 g/L。用紫外诱变法、氯化锂诱变法、紫外氯化锂复合诱变法诱变菌株CK-5，得到菌株CK-U76，菌株CK-U76的PHB产量为4.6 g/L，比菌株CK-5的PHB产量提高了35.3％。通过形态学观察和分子生物学鉴定，CK-U76被鉴定为芽孢杆菌属。
　　 通过Box-Behnken Design设计和响应面分析优化，对菌株CK-U76的发酵条件进行初步研究，得到菌株CK-U76最佳的发酵条件:以甘油为碳源，碳源浓度10.98 g/L，酵母膏和蛋白胨作为联合氮源，氮源浓度25.25 g/L，pH为8.05，发酵温度为20℃，发酵时间为72 h，转速为180 r/min，装液量为150mL，接种量为10％。在此条件下菌株CK-U76的PHB产量达到15.9g/L，比未优化之前的4.6 g/L提高了246％。
　　 本实验也对菌株CK-U76的提取方法进行了初步研究，从经济安全的角度来说，冻融法比较合适，综合PHB提取率、PHB纯度、PHB分子量来说，SDS法最合适的提取方法，因此选择此方法作为PHB的提取方法。本实验采用紫外分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱法对菌株CK-U76的所产PHB进行定性定量分析，紫外分光光度法是比较灵敏的一种方法，在波长为235nm处对PHB进行定性定量分析，但是样品处理过程复杂，分析结果易受有机杂质干扰，影响其准确性;用高效液相色谱法来对PHB进行分析,操作方便，准确性较高，适合对PHB进行定向定量分析;气相色谱法的优点在于不需要对细胞进行处理，峰图较好，不过反应时间比较长，中间过程难以控制。
　　 本实验选育出一株PHB的菌株CK-U76，通过形态学观察和分子生物学鉴定，CK-U76被鉴定为芽孢杆菌属。运用响应面法优化菌株CK-U76的发酵条件，PHB产量从4.6 g/L提高到15.9 g/L。同时对其提取条件和分析方法进行了初步研究，对PHB的工业化生产可以提供一定的参考价值。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 PHB研究背景

1．2 PHB的结构及理化性质

1．3 PIIB的合成方法

1．3．1 化学合成法

1．3．2 微生物合成法

1．3．3 基因合成法

1．4 微生物法生产PHB的研究现状

1．5 PHB的提取方法

1．5．1 有机溶剂提取法

1．5．2 冻融法

1．5．3 机械破碎法

1．5．4 次氯酸钠提取法

1．5．5 酶法

1．5．6 表面活性剂-次氯酸钠法

1．6 PHB的分析方法

1．6．1 染色法

1．6．2 重量分析法

1．6．3 紫外分光光度法

1．6．4 气相色谱法

1．6．5 高效液相色谱法

1．6．6 核磁共振法

1．6．7 红外光谱法

1．7 PHB的应用

1．8 本实验的研究意义、目的、内容

第二章 PHB高产菌株的筛选

2．1 实验材料

2．1．1 土样来源

2．1．2 主要实验仪器和设备

2．1．3 主要实验试剂

2．1．4 实验培养基

2．1．5 试剂配制

2．2 实验方法

2．2．1 从自然界中筛选产PHB菌株

2．2．2 PHB高产菌株的诱变筛选

2．2．3 菌种的鉴定

2．3 结果与分析

2．3．1 PHB菌株的筛选

2．3．2 菌株CK-5的诱变筛选

2．3．3 菌落形态特征观察

2．3．4 PHB分子量的测定

2．3．5 菌株PHB积累曲线的测定

2．3．6 PHB降解性的初步研究

2．3．7 CK-U76 16S rRNA序列分析

2．4 小结与讨论

第三章 响应面法优化菌株CK-U76发酵条件的初步研究

3．1 响应面法简介

3．2 实验材料

3．2．1 实验菌种

3．2．2 主要实验仪器及设备

3．2．3 主要实验试剂

3．2．4 实验培养基

3．3 实验方法

3．3．1 菌株CK-U76产PHB单因素实验设计

3．4 单因素实验结果与分析

3．4．1 碳源对菌株CK-U76产PHB的影响

3．4．2 氮源对菌株CK-U76产PHB的影响

3．4．3 pH对菌株CK-U76产PHB的影响

3．4．4 温度对菌株CK-U76产PHB的影响

3．4．5 接种量对菌株CK-U76产PHB的影响

3．4．6 转速对菌株CK-U76产PHB的影响

3．4．7 装液量对菌株CK-U76产PHB的影响

3．5 响应面法优化发酵培养基及培养条件

3．6 小结与讨论

第四章 PHB提取方法和分析方法初步探究

4．1 实验材料

4．1．1 实验菌种

4．1．2 主要实验仪器及设备

4．1．3 主要实验试剂

4．1．4 实验培养基

4．2 实验方法

4．2．1 PHB的提取方法

4．2．2 PHB分析方法

4．3 结果与分析

4．3．1 PHB提取方法比较研究

4．3．2 PHB的分析方法

4．4 小结与讨论

第五章 总结和展望

5．1 总结

5．2 展望

参考文献

附录

附录1 主要仪器设备

附录2 主要实验试剂

附录3 实验培养基

附录4 菌株CK-U76的测序结果

致谢