重组牛生长激素注射于泌乳水牛后潜在生物靶标的研究

摘要

生长激素(Growth hormone,GH),又称促生长素,它是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一类单链肽激素,与催乳素(PRL)和胎盘催乳素(PL)同属于1个基因家族,广泛存在于各种脊椎动物中。它的主要作用是刺激机体生长,提高组织和细胞新陈代谢。重组牛生长激素(Recombinant bovine growth hormone,rbGH)如今被美国等国家广泛用于畜牧生产中,将其注射奶牛,可显著提高奶牛的产奶量。研究发现,注射了rbGH的奶牛会出现极其严重的乳房炎、跛行、生殖障碍等疾病,而摄入这种牛奶的人们也存在更高的致癌风险。据此欧盟成员国和加拿大明令禁止使用rbGH,但是滥用rbGH以获得暴利仍无法避免。
　　为了有效监管rbGH的使用,建立一套检测方法来鉴定动物是否注射了rbGH显得极为重要。由于rbGH和天然bGH具有极高的相似性,通过直接检测方法区分这两者是极其困难的。因此,开发包括生物靶标在内的间接分析方法则可能是检测rbGH有效的替代方案。本研究主要分为两大部分:1)制备针对rbGH的单克隆抗体,建立检测血清GH、血清胰岛素样生长因子(IGF-1)和牛奶IGF-1的双夹心ELISA方法;2)建立检测外周血白细胞差异表达基因靶标的方法。
　　由于目前对水牛尚无GH研究的相关报道,本研究以水牛为模式动物,应用韩国LG生命科学公司的rbGH注射8头泌乳水牛,每两周注射1次,共注射5次,持续10周(每2周为一个周期,共5个周期)。血液样品于每次rbGH注射后的第2、5、9、14天收集;牛奶样品从第1和第5周期的第2、7、14天收集;外周血白细胞样品收集于每个注射周期的第2和第14天。
　　为了区分高度相似的rbGH和天然bGH,本研究制备了具有高度特异性和敏感性的单克隆抗体2A3和3G6,其中2A3能将高度相似的rbGH和天然bGH完全区分开。建立了三种双夹心ELISA方法分别检测血清GH、血清IGF-1及牛奶IGF-1的水平。并用统计学方法验证这三种方法的灵敏性、特异性、准确性和可重复性,证实了方法的有效性。同时,它们的最低检出值可分别达到0.089ng/ml、20ng/ml、0.025ng/ml。
　　双夹心ELISA检测的结果显示:1)与对照组相比,在每次rbGH注射后的第2天,实验组水牛血清中GH的水平显著的升高(p<0.001),尽管随后就迅速下降,但是在第5天仍显著高于对照组(p<0.001),到第9和14天才恢复到了基础水平。可见,血清GH含量能作为检测水牛是否注射rbGH的一个良好和可靠的指标,但是血清GH含量在达到峰值后迅速下降的现象限制了样品检测的时间。2)在rbGH注射后的第2天,实验组水牛血清中IGF-1的浓度迅速提高(p<0.001),并在第5天或第9天达到峰值。尽管在第14天,血清IGF-1的含量已有所下降,但其平均值仍显著高于对照组(p<0.01)。表明血清IGF-1含量的检测比起血清GH具有更长的检测周期,在rbGH注射后两周内采集样品都能检测到。而且,如果用该检测方法发现在同一养殖场的动物血清中都检测出高浓度的IGF-1则是注射了rbGH的重要判断依据。3)水牛奶中IGF-1的含量在整个rbGH注射周期中都显著增加,在第2天(p<0.001)和第7天(p<0.01)达到峰值,比对照组高出2.3倍。由于牛奶中高水平IGF-1对公共卫生的潜在危害,因此注射rbGH后水牛奶中较高浓度的IGF-1,不单单只作为鉴定rbGH注射的指标,更是在食品安全中需要密切监测的对象。
　　运用基因芯片筛选到了rbGH注射水牛和对照水牛外周血白细胞中的差异表达基因,发现其中有110个基因出现上调或下调,并从中筛选出10个差异最明显,表达最稳定的基因(ABCG1,DQA1,DQA5,DQB,DLC,Ferritin-like heavy chain,Integrinβ-fragment,KKCC,TKDP3,SUCLG)。随后运用实时定量PCR技术检测水牛外周血白细胞中这10个通过基因芯片技术筛选出来的基因,以及15个基因的表达水平,其中包括属于生长轴的10个基因(GHR、IGF-1、IGF-2、IGFBP-1、-2、-3、-4、-5、-6、IGF-1R),5个生长激素受体5非翻译区的突变体(1B、1C1、1C3、1D、1I)。结果显示,rbGH显著地影响着水牛外周血白细胞中一些基因的表达(IGFBP-1,p<0.001;DQA5,p<0.01;DQB p<0.05;DLC p<0.001;Ferritin-like heavy chain,p<0.05;Integrinβ-fragment,p<0.05)。其中DQA5的表达水平在注射了rbGH后显著地增加并维持在较高的水平,未注射rbGH的水牛几乎无法检测到DQA5的表达(其中只有一头患乳房炎的水牛检测到了DQA5的高表达)。由此可见,DQA5也能作为鉴定rbGH注射的生物靶标,但是必须谨慎使用,以防假阳性的出现。
　　本研究通过建立免疫分析和基因靶标检测方法来鉴定模式动物水牛是否注射了rbGH,并且通过潜在生物靶标(包括血清GH、血清IGF-1、牛奶IGF-1及25个水牛外周血白细胞基因)的检测,证实了所建立方法的可行性,为今后方法的进一步标准化、我国有效监管rbGH使用方法的出台和rbGH相关研究的深入开展奠定了基础,对我国的食品安全监测有积极意义。

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Abbreviation

Introduction

1. Materials and methods

1.1 Immunochemistry analysis

1.2 Experimental design for in vivo rbGH treatment of buffalos and analysis schedule

2. Results and Discussion

2.1 Immunoenzymatic assays to measure GH and IGF-1

2.2 Searching of biomarkers by gene expression analysis in the white blood cells

5. Conclusion

参考文献

Appendix

致谢

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