缝隙连接蛋白抗C乳x4腺3形成的GJIC对阿霉素体外癌作用的影响

摘要

目的：
　　1.检测恶性程度不同的乳腺癌细胞（Hs578T、MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3）中缝隙连接蛋白43（connexin43，Cx43）的表达。
　　2.在乳腺癌细胞（Hs578T、MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3）中，分别用药理学方法（GJ工具药）和分子生物学方法（siRNA）改变其GJ功能，观察对阿霉素（adriamycin，ADM）抗肿瘤作用的影响。
　　方法：
　　1.不同恶性程度乳腺癌细胞中Cx43表达及其形成GJ功能的检测
　　1.1 Western blotting检测上述乳腺癌细胞Cx43的表达水平。
　　1.2免疫荧光法（Immunofluorescence Assay）检测上述乳腺癌细胞膜表面Cx43蛋白表达。
　　1.3细胞接种荧光示踪法（Parachute Assay）检测乳腺癌细胞间荧光传递功能，即细胞GJ功能。
　　2 GJ功能改变后对阿霉素抗肿瘤作用的影响
　　2.1 MTT法检测不同浓度ADM（0、1.5、3.0、6.0、12.0、24.0μM）作用24 h、36 h和48 h后，对四种乳腺癌细胞（Hs578T、MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3）生长的抑制作用。
　　2.2用不同密度接种细胞的方法，获得生长融合细胞（细胞之间有紧密接触，有条件形成GJ）与生长未融合细胞（细胞之间无接触，无形成GJ的条件），在上述不同密度接种的细胞，观察GJ形成对ADM的细胞毒性的影响。
　　2.3 GJ功能的调节：
　　2.3.1工具药：GJ功能增强剂维甲酸（retinoic acid，RA）和GJ功能抑制剂油酸酰胺（oleamide）、18-α-甘草次酸（18-α-glycyrrhetinic acid，18-α-GA）分别调控乳腺癌细胞GJ功能后，检测对ADM抗肿瘤作用的影响；
　　2.3.2分子生物学方法：设计针对人乳腺癌细胞Cx43的siRNA序列；用Western blotting、“细胞免疫荧光法”和“细胞接种荧光示踪法”检测siRNA对Cx43表达和GJ功能的抑制作用。用“MTT”法观察siRNA对ADM细胞毒性的影响。
　　结果：
　　1. Hs578T、MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3细胞中Cx43的表达
　　本实验采用Western blotting检测四种乳腺癌细胞中Cx43蛋白的表达，结果显示：恶性程度最低的Hs578T细胞Cx43表达水平最高，其次为MCF-7、SK-BR-3，而恶性程度最高的MDA-MB-231细胞中Cx43蛋白表达水平最低。提示，恶性程度较高的乳腺癌细胞Cx43蛋白表达水平反而较低。
　　2. Hs578T、MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3细胞膜表面Cx43的表达
　　“细胞免疫荧光法”（Immunofluorescence）检测乳腺癌细胞膜Cx43的表达。与Western blotting实验结果相似的是：恶性程度最低的Hs578T细胞膜表面Cx43蛋白表达最高，其次为MCF-7、SK-BR-3，而恶性程度最高的MDA-MB-231细胞膜表面Cx43蛋白表达最低。
　　3. ADM对四种乳腺癌细胞的生长抑制作用
　　MTT结果显示不同浓度的ADM均能抑制乳腺癌细胞生长，且随着ADM浓度的增加和作用时间的延长，细胞的存活率降低，且24.0μM ADM对四株乳腺癌细胞的生长抑制作用最强。24.0μM的ADM作用细胞24 h后，Hs578T、MCF-7、MDA-MB-231和SK-BR-3细胞的生长抑制率分别为：25.38％、46.12%、43.41%和31.35%。24.0μM的ADM作用细胞36 h后，Hs578T、MCF-7、MDA-MB-231和SK-BR-3细胞的生长抑制率分别为：58.71%、48.87%、66.74%和53.47%。24.0μM的ADM作用细胞48 h后，Hs578T、MCF-7、MDA-MB-231和SK-BR-3细胞的生长抑制率分别为：72.48%、47.04%、97.97%和70.24%。因此我们可以看出MDA-MB-231细胞对ADM最为敏感，而MCF-7对细胞随着时间的延长，敏感性降低。
　　4. GJ功能增强剂对ADM抗肿瘤作用的影响
　　细胞接种荧光示踪法（Parachute Assay）实验结果表明，GJ功能增强剂维甲酸（ratinoic acid，RA）10μM预处理乳腺癌细胞24 h，细胞荧光传递功能显著增强。Hs578T、MCF-7、MDA-MB-231和SK-BR-3细胞荧光传递分别增强了39.50%、148.04%、57.25%和102.3%（与对照组相比，P<0.01）。
　　采用MTT法检测10μM RA对ADM细胞毒性的影响，实验结果表明，在高密度接种的乳腺癌细胞（生长融合，有GJ形成），10μM RA增强GJ功能后，6μM ADM处理乳腺癌细胞24 h，细胞存活率显著降低（P<0.01）；在低密度接种的乳腺癌细胞（生长未融合，无GJ形成），10μM RA预处理组的细胞存活率与单用ADM组相比，无显著变化（P>0.05）。
　　结果表明，RA可以通过增强乳腺癌细胞的GJ功能增加ADM的细胞毒性。
　　5. GJ功能抑制剂对ADM抗肿瘤作用的影响
　　5.1 Oleamide抑制乳腺癌细胞GJ功能，ADM的细胞毒性降低
　　细胞接种荧光示踪实验结果显示，GJ功能抑制剂油酸酰胺（Oleamide）25μM预处理乳腺癌细胞1 h，细胞GJ功能显著降低。实验结果表明，oleamide能够抑制细胞GJ的功能，Hs578T、MCF-7、MDA-MB-231和SK-BR-3细胞荧光传递分别降低了47.94%、81.32%、88.02%和30.00%（与对照组相比， P<0.01）。
　　采用MTT法检测25μM oleamide对ADM细胞毒性的影响，实验结果表明，在高密度接种的乳腺癌细胞（生长融合，有GJ形成），25μM oleamide抑制细胞GJ功能后，6μM ADM作用细胞24 h，细胞存活率显著增加（P<0.01）；在低密度接种的乳腺癌细胞（生长未融合，无GJ形成），25μM oleamide预处理组细胞存活率与单用ADM组无显著变化（P>0.05）。
　　结果表明，oleamide可以通过抑制乳腺癌细胞GJ功能降低ADM的细胞毒性。
　　5.218-α-GA抑制乳腺癌细胞GJ功能，ADM的细胞毒性降低
　　GJ功能抑制剂18-α-甘草次酸（18-α-GA）10μM预处理乳腺癌细胞1 h， Hs578T、MCF-7、MDA-MB-231和 SK-BR-3荧光传递分别降低了76.19%、31.64%、83.94%和81.17%（与对照组相比P<0.01）。
　　采用MTT法观察10μM18-α-GA对ADM细胞毒性的影响，实验结果表明，在高密度接种的乳腺癌细胞（生长融合，有GJ形成），10μM18-α-GA抑制细胞GJ功能后，6μM ADM作用乳腺癌细胞24 h，细胞存活率显著增加（P<0.01）；而在低密度接种的乳腺癌细胞（生长未融合，无GJ形成），10μM18-α-GA预处理组细胞存活率与单用ADM组相比，无显著变化（P>0.05）。
　　实验结果表明，18-α-GA可以通过抑制乳腺癌细胞GJ功能降低ADM的细胞毒性。
　　6．特异性抑制Cx43的siRNA对ADM抗肿瘤作用的影响
　　5.2.1 siRNA处理Hs578T细胞，ADM细胞毒性降低
　　Western blotting实验结果显示， Hs578T细胞中Cx43蛋白表达显著降低（P<0.01）；细胞免疫荧光法结果显示：siRNA处理后的细胞膜Cx43表达水平显著降低；细胞接种荧光示踪实验显示：siRNA能够显著抑制Hs578T细胞GJ功能（P<0.01）；MTT法实验结果显示：在高密度接种的Hs578T细胞，siRNA预处理Hs578T细胞48 h，ADM作用于细胞24 h的细胞存活率显著高于单用ADM组（P<0.01）；而在低密度接种的细胞，siRNA预处理组细胞存活率与单用ADM组相比，无显著性差异（P>0.05）。
　　5.2.2 siRNA处理MCF-7细胞，ADM细胞毒性降低
　　Western blotting实验结果显示：siRNA预处理乳腺癌细胞48 h，MCF-7细胞中Cx43蛋白表达显著降低（P<0.01）；细胞免疫荧光法结果显示：siRNA处理后的细胞膜表达Cx43水平降低；细胞接种荧光示踪实验显示：siRNA可以显著抑制乳腺癌细胞MCF-7的GJ功能（P<0.01）；MTT法实验结果显示：在高密度接种的细胞，用siRNA预处理MCF-7细胞48h后，ADM刺激细胞24 h的细胞存活率显著高于单用ADM组（P<0.01）；而在低密度接种的乳腺癌细胞，siRNA预处理组的细胞存活率与单用ADM组无显著性差异（P>0.05）。
　　分子生物学实验结果表明，在高密度接种的乳腺癌细胞（细胞融合，有GJ形成），siRNA可以通过抑制Cx43表达降低细胞GJ功能，同时降低ADM的细胞毒性。而在低密度接种的乳腺癌细胞，siRNA对ADM的细胞毒性无显著变化。
　　结论：
　　1.恶性程度不同的乳腺癌细胞（Hs578T、MCF-7、MDA-MB-231和SK-BR-3）表达不同水平的Cx43，其中恶性程度最低的Hs578T细胞Cx43蛋白表达最多，而恶性程度最高的MDA-MB-231细胞Cx43蛋白表达最弱。
　　2.乳腺癌细胞中，GJ形成能够显著增强ADM的细胞毒性，Cx在未形成GJ前并不影响ADM的细胞毒性。
　　3.抑制乳腺癌细胞GJ功能能够显著降低ADM的细胞毒性，增强细胞GJ功能可以增加ADM的细胞毒性。

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中文摘要

英文摘要

前言

1. 细胞缝隙连接（Gap junction，GJ）

2. GJ与抗肿瘤药物的关系

材料与方法

1 材料

2 主要仪器和设备

3 方法

4 统计学处理方法

实验结果

1 乳腺癌细胞中Cx43的表达

2 乳腺癌细胞膜表面Cx43的表达

3 乳腺癌细胞内GJ功能改变对阿霉素细胞毒性的影响

4 特异性抑制Cx43的siRNA对ADM抗肿瘤作用的影响

讨论

结论

课题创新点

参考文献

致谢

附录 A主 要 英 文 缩 略 词 表

附录B主要试剂配制方法

附录C个人简历及发表的文章

附录D 综述： 连接蛋白――乳腺癌治疗的新靶点