缝隙连接蛋白Cx43形成的GJIC对奥沙利铂体外抗睾丸癌作用的影响

摘要

目的：⑴检测睾丸正常细胞（TM3、TM4）和睾丸肿瘤细胞（I-10）中缝隙连接蛋白43（connexin43,Cx43）的表达。⑵运用GJ工具药，改变GJ功能后，观察奥沙利铂（oxalipatin, OHP）细胞毒性的变化。⑶探讨缝隙连接功能与奥沙利铂抗肿瘤作用之间可能的机制。
　　方法：①Western blotting检测睾丸细胞Cx43的表达水平。②免疫荧光法（Immunofluorescence Assay）检测睾丸细胞膜表面Cx43蛋白的表达。③细胞接种荧光示踪法（Parachute Assay）检测睾丸细胞间的荧光传递功能，即细胞GJ功能。④MTT法检测高低密度接种细胞条件下，(0、5.0、10.0、20.0、40.0μM) oxaliplatin, OHP作用睾丸细胞24 h后，睾丸细胞（TM3、I-10）的存活率。⑤用不同密度接种细胞（1×104-8×104cells/ml）的方法，获得生长融合细胞（细胞之间紧密接触，有条件形成GJ）与生长未融合细胞（细胞单个生长，无条件形成GJ），随着密度的增加，生长融合程度增加，观察融合程度对(oxaliplatin,OHP)细胞毒性的影响。⑥工具药：GJ功能增强剂维甲酸（retinoic acid, RA）和GJ功能抑制剂油酸酰胺（oleamide）、18-α-甘草次酸（18-α-glycyrrhetinic acid，18-α-GA）分别调控睾丸细胞GJ功能后，MTT法检测OHP对睾丸细胞增殖抑制的变化，Annexin V/PI双染方法，检测OHP诱导的细胞早期凋亡的变化。⑦调控GJ功能后，Western blot检测，OHP诱导的凋亡蛋白Bcl-2、Bax和抗增殖蛋白Prohibitin的表达。
　　结果：⑴采用western blotting检测三种睾丸细胞中Cx43蛋白的表达，结果显示：睾丸正常细胞TM3、TM4中Cx43表达水平相对较高，睾丸肿瘤细胞I-10中Cx43表达水平较低。提示，睾丸肿瘤细胞中Cx43蛋白表达降低。⑵细胞免疫荧光法（Immunofluorescence）检测睾丸细胞膜Cx43的表达。结果表明：睾丸正常细胞TM3、TM4中Cx43表达水平相对较高，睾丸肿瘤细胞I-10中Cx43表达水平较低。⑶MTT结果显示(0、5.0、10.0、20.0、40.0μM) OHP均能抑制睾丸细胞生长，且随着OHP浓度的增加，细胞的存活率降低；在TM3细胞中，高密度接种细胞时（生长融合，有GJ形成），OHP对细胞增殖抑制作用低于低密度接种细胞（生长未融合，无GJ形成）；在I-10细胞中，高密度接种细胞时（生长融合，有GJ形成），OHP对细胞增殖抑制作用高于低密度接种细胞（生长未融合，无GJ形成）。⑷MTT结果显示，在1×104-8×104 cells/ml的范围内，随着细胞密度的增加，10μM OHP作用24 h后，在TM3细胞中，OHP对细胞增殖抑制作用逐渐降低，而在I-10细胞中，OHP对细胞增殖抑制作用逐渐增强。⑸细胞接种荧光示踪法（Parachute Assay）实验结果表明，10μM维甲酸(ratinoic acid，RA)处理细胞24 h，细胞荧光传递功能显著增强，TM3、I-10细胞荧光传递分别增强了40.36％±0.03、41.23%±0.04。⑹采用MTT法检测10μM RA对OHP细胞增殖抑制的影响，实验结果表明，在高密度接种的睾丸细胞（生长融合，有GJ形成），10μM RA增强GJ功能后，10μM OHP作用睾丸细胞24 h，TM3细胞存活率显著增加（P<0.01）,I-10细胞存活率显著降低（P<0.01）;在低密度接种的睾丸细胞（生长未融合，无GJ形成），10μM RA预处理组的细胞存活率与单用OHP组相比，无显著变化（P>0.05）。⑺采用Annexin V/PI双染检测10μM RA对OHP诱导的睾丸细胞的早期凋亡的影响，实验结果表明，在高密度接种的睾丸细胞（生长融合，有GJ形成），10μM RA增强GJ功能后，20μM OHP作用睾丸细胞12 h，OHP诱导的TM3细胞早期凋亡率降低（P<0.01），而OHP诱导的I-10细胞早期凋亡率增加（P<0.01）。⑻细胞接种荧光示踪法（Parachute Assay）实验结果表明，10μM18-α-GA预处理睾丸细胞1 h，细胞GJ功能显著降低，TM3、I-10细胞荧光传递分别降低了56.19%±0.03、61.64%±0.02。细胞接种荧光示踪法（Parachute Assay）实验结果表明，25μM oleamide预处理睾丸细胞1 h，细胞GJ功能显著降低，TM3、I-10细胞荧光传递分别降低了61.21%±0.02、59.32%±0.03。⑼采用MTT法检测10μM18-α-GA对OHP细胞毒性的影响，实验结果表明，在高密度接种的睾丸细胞（生长融合，有GJ形成），10μM18-α-GA抑制GJ功能后，10μM OHP作用睾丸细胞24 h，TM3细胞存活率显著降低(P<0.01)，I-10细胞存活率显著增加（P<0.01）;在低密度接种的睾丸细胞（生长未融合，无GJ形成），10μM18-α-GA预处理组的细胞存活率与单用OHP组相比，无显著变化（P>0.05）。采用MTT法检测25μM oleamide对OHP细胞毒性的影响，实验结果表明，在高密度接种的睾丸细胞（生长融合，有GJ形成），25μM oleamide抑制GJ功能后，10μM OHP作用睾丸细胞24 h，TM3细胞存活率显著降低(P<0.01)，I-10细胞存活率显著增加（P<0.01）;在低密度接种的睾丸细胞（生长未融合，无GJ形成），25μM oleamide预处理组的细胞存活率与单用OHP组相比，无显著变化（P>0.05）。⑽采用Annexin V/PI双染检测10μM18-α-GA对OHP诱导的睾丸细胞的早期凋亡的影响，实验结果表明，在高密度接种的睾丸细胞（生长融合，有GJ形成），10μM18-α-GA抑制GJ功能后，20μM OHP处理睾丸细胞6 h，OHP诱导的TM3细胞早期凋亡率增加(P<0.01)，而OHP诱导的I-10细胞早期凋亡率降低(P<0.01)。采用Annexin V/PI双染检测25μM oleamide对OHP诱导的睾丸细胞的早期凋亡的影响，实验结果表明，在高密度接种的睾丸细胞（生长融合，有GJ形成），25μM oleamide抑制GJ功能后，20μM OHP处理睾丸细胞6 h，OHP诱导的TM3细胞早期凋亡率增加(P<0.01)，而OHP诱导的I-10细胞早期凋亡率降低(P<0.01)。⑾采用Western blot方法检测，GJ对OHP诱导的凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达的影响。增强GJ功能，在TM3细胞中，OHP诱导的Bcl-2/Bax蛋白的表达增加(P<0.01)；在I-10细胞中，OHP诱导的Bcl-2/Bax蛋白的表达降低(P<0.01)，抑制GJ功能，在TM3细胞中，OHP诱导的Bcl-2/Bax蛋白的表达降低(P<0.01)，在I-10细胞中，OHP诱导的Bcl-2/Bax蛋白的表达增加(P<0.01)。采用Western blot方法检测，GJ对OHP诱导的凋亡相关蛋白Prohibitin表达的影响。增强GJ功能，在TM3细胞中，OHP诱导的Prohibitin蛋白的表达降低(P<0.01)，在I-10细胞中，OHP诱导的Prohibitin蛋白的表达增加(P<0.01)；抑制GJ功能，在TM3细胞中，OHP诱导的Prohibitin蛋白的表达增加(P<0.01)，在I-10细胞中， OHP诱导的Prohibitin蛋白的表达降低(P<0.01)。
　　结论：①睾丸正常细胞（TM3、 TM4）和睾丸肿瘤细胞（I-10）中表达不同水平的Cx43，正常细胞中Cx43表达高于肿瘤细胞。②GJ形成能够显著降低OHP的TM3细胞毒性作用，增强OHP的I-10细胞毒性的作用。③增强GJ功能够显著降低OHP的TM3细胞毒性作用，增强OHP的I-10细胞毒性的作用；抑制GJ功能够显著增加OHP的TM3细胞毒性作用，降低OHP的I-10细胞毒性的作用。④Bcl-2/Bax、 prohibitin可能参与GJ在睾丸细胞对奥沙利铂细胞毒性的影响。

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前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

课题创新点

参考文献

致谢

附录 A

附录B主要试剂配制方法

附录C个人简历及发表的文章

附录D 综述： Cx43在睾丸中的研究进展