Viperin抑制狂犬病病毒机理的探索研究

摘要

Viperin是一种干扰素诱导蛋白，可通过完全不同的机制对多种病毒发挥抗病毒活性。先前的研究没有viperin抑制狂犬病病毒(RABV)复制的报道。通常狂犬病病毒在其易感细胞中生长良好，具有较高的病毒滴度。最近我们的研究中发现，狂犬病病毒在巨噬细胞RAW264.7中生长缓慢，病毒滴度显著地低于易感细胞（如NA细胞）。进一步的研究发现，狂犬病病毒感染易感的NA细胞时，viperin表达微弱或不表达，但感染巨噬细胞时viperin被显著诱导表达。
　　本研究为了探索抗病毒蛋白viperin的表达是否抑制狂犬病病毒的复制，我们构建了viperin的真核表达载体，通过瞬时转染BSR-T7细胞，过表达viperin，证实了过表达viperin能抑制狂犬病病毒rRC-HL的复制，在一定范围内狂犬病病毒N、P和M蛋白在细胞中的表达量明显被抑制，狂犬病病毒滴度显著降低。通过筛选稳定表达viperin的BHK-21细胞系，感染狂犬病病毒，发现稳定表达viperin的BHK-21细胞系对狂犬病病毒rRC-HL株的抑制效果更加明显，显著抑制了病毒蛋白的合成。同样稳定表达viperin的BHK-21细胞系显著抑制广西分离强毒Ⅰ群和Ⅲ群代表株GX01和GXN119。
　　在此基础上，为了进一步探索viperin抑制狂犬病病毒主要功能区域，本实验构建了缺失viperin N末端两亲性的a螺旋区域及突变S-腺苷甲硫胺酸酶基序的突变体，测定这些突变体抑制狂犬病病毒的效果，结果显示viperin的抑制狂犬病病毒复制活性区域主要位于其N末端，其突变后抗狂犬病病毒能力显著下降。S-腺苷甲硫胺酸酶基序的3个关键氨基酸(C83A/C87A/C90A)突变后，其抑制狂犬病病毒的能力也明显下降。
　　先前的研究发现viperin的N末端可结合细胞的内质网及脂滴，扰乱细胞膜的脂筏结构来抑制病毒的出芽与释放。为了探索viperin抑制狂犬病病毒复制的机理，本实验就viperin对脂筏的重要组成成分胆固醇和鞘磷脂的生物学作用进行探索。首先在BSR-T7细胞中过表达viperin，检测细胞中胆固醇和鞘磷脂变化情况。结果显示，过表达viperin能够降低细胞中胆固醇和鞘磷脂的含量，推测viperin可能通过破坏胆固醇和鞘磷脂以抑制狂犬病病毒释放。同时添加分别抑制胆固醇和鞘磷脂的药物Mβ CD和Myroicin，发现破坏细胞的胆固醇和鞘磷脂对狂犬病病毒的吸附与穿入无影响，但对狂犬病病毒的出芽与释放有抑制作用，证实了破坏细胞的胆固醇和鞘磷脂是viperin抑制狂犬病病毒复制的重要途径之一。
　　Viperin是干扰素诱导蛋白，受干扰素的诱导和调控，本实验进一步探索狂犬病病毒感染巨噬细胞上调viperin基因的上游信号传导通路，应用芯片技术对狂犬病病毒感染RAW264.7细胞后，84个免疫应答基因及几个主要看家基因转录谱进行了分析。结果显示，狂犬病病毒感染巨噬细胞后12、24和36 h三个时间点都上调2倍以上的基因共有26个;12h上调2倍以上、24和36 h无明显变化的基因有2个;12和24 h上调2倍以上、36 h无明显变化的基因有1个;12h无变化、24和36 h上调2倍以上的基因有15个;12和24 h无变化、36 h上调2倍以上的基因有17个;12、24和36 h三个时间点都没有明显变化（小于2倍）的基因有25个;12、24和36 h三个时间点都下调2倍以上的基因有1个。其中，Cxcl10基因在12、24和36 h三个时间点上调倍数分别为377.85、333.14和183.12倍;IFNβ基因分别为370.07、68.12和13.09倍。狂犬病病毒感染RAW264.7细胞也会引起TLRs不同程度升高，TLR3基因分别为156.68、380.03和164.66倍，TLR2和TLR8基因呈一定程度的上调表达，TLR1、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7和TLR9也有较显著的变化。
　　上述实验证明TLRs参与了狂犬病病毒感染RAW264.7细胞的免疫信号传导。根据TLR4能够识别病毒的囊膜蛋白传递免疫信号和激活机体固有免疫、TLR3识别双链RNA(dsRNA)和病毒复制过程中产生的中间复合物的特性，本研究使用流式细胞术证明了巨噬细胞感染狂犬病病毒后，显著上调TLR4的表达，说明狂犬病病毒激活了TLR4;然而再用灭活的狂犬病病毒孵育巨噬细胞，发现保留了基本自然特性的狂犬病病毒囊膜糖蛋白能够诱导viperin的表达。进一步用TLR4的特异性抑制剂(TAK-242)阻断TLR4信号的传导，显示viperin的表达量显著减少，说明TLR4参与了识别狂犬病病毒并诱导viperin表达。为了验证TLR3与狂犬病病毒相互作用及其诱导viperin表达的固有免疫反应，本实验首先构建了TLR3基因敲除的TLR3-/-RAW264.7细胞系，感染狂犬病病毒，检测viperin蛋白的变化情况，显示敲除了TLR3基因的TLR3-/-RAW264.7细胞可显著推迟并减少viperin蛋白表达量，说明TLR3参与识别狂犬病病毒核酸并诱导viperin的表达。
　　NF-κB和IRF3是固有免疫信号通路中两个重要的免疫因子，用NF-κB的特异性抑制剂抑制其通路的信号传导，然后感染狂犬病病毒，结果显示抑制NF-κB通路的信号传导，viperin的表达量几乎不受影响，说明狂犬病病毒上调viperin与NF-κB信号通路没有直接关联性。用IRF3的特异性抑制剂格尔德霉素抑制处理细胞后，可抑制IRF3的分子伴侣Hsp90，使viperin的表达时间推迟并减少表达量，说明IRF3参与了狂犬病病毒诱导viperin表达的调控。
　　综上所述，狂犬病病毒感染巨噬细胞RAW264.7可诱导干扰素诱导蛋白viperin表达，viperin表达具有抑制狂犬病强毒、弱毒复制的作用。这种抑制作用主要通过破坏RAW264.7细胞膜的胆固醇和鞘磷脂，阻碍病毒的出芽和释放。进一步的芯片技术研究发现，巨噬细胞RAW264.7感染狂犬病病毒时多数TLRs的表达受到影响。当用狂犬病病毒感染敲除TLR3基因的TLR3-/-RAW264.7细胞，viperin的表达量比正常RAW264.7细胞显著减少并延后;用TLR4抑制剂TAK-242可抑制狂犬病病毒诱导viperin的产生;因此，viperin的诱导受上游TLR3/TLR4的调控。通过系统研究，阐明了狂犬病病毒感染巨噬细胞RAW264.7诱导viperin的分子通路，具有重要的理论价值和实践意义。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

第一章 文献综述

1．1 狂犬病的流行病学

1．1．1 狂犬病的全球概况

1．1．2 狂犬病病毒的宿主范围

1．1．3 狂犬病的临床症状

1．2 狂犬病病毒分子结构

1．3 狂犬病的发病机制

1．3．1 糖蛋白和致病性

1．3．2 细胞死亡和致病性

1．3．3 狂犬病病毒逃避先天免疫反应

1．4 狂犬病病毒感染的免疫应答

1．5 狂犬病病毒感染与Toll样受体通路的免疫反应

1．5．1 Toll样受体及其与狂犬病病毒的相互作用

1．5．2 狂犬病病毒感染的免疫应答涉及TLR7

1．5．3 狂犬病病毒感染MyD88敲除的小鼠

1．6 Viperin

1．6．1 Viperin的结构与特征

1．6．2 Viperin表达调控

1．6．3 Viperin的抗病毒功能

1．6．4 Viperin在免疫信号与免疫反应中的作用

1．6．5 病毒逃避与利用viperin

1．7 挑战与展望

第二章 Viperin抑制狂犬病病毒的复制是通过破坏细胞膜胆固醇和鞘磷脂

2．1 材料

2．1．1 细胞和病毒

2．1．2 质粒

2．1．3 抗体

2．1．4 主要仪器

2．1．5 主要的试剂

2．1．6 引物设计与合成

2．2 方法

2．2．1 重组狂犬病病毒的拯救

2．2．2 病毒效价的滴定

2．2．3 不同细胞对狂犬病病毒的易感性实验

2．2．4 Western blot

2．2．5 大肠杆菌培养基的配制

2．2．6 制备感受态细胞大肠杆菌DH5a所用试剂的配制

2．2．7 细胞培养所用溶液

2．2．8 细胞或小鼠脑组织总RNA的提取

2．2．9 QRT-PCR

2．2．10 real-time PCR反应条件的优化

2．2．11 标准曲线的制作

2．2．12 实时定量PCR实验

2．2．13 BHK-GFP或BHK-viperin-GFP细胞系构建

2．2．14 MβCD与myriocin对细胞毒性的检测

2．2．15 免疫共沉淀

2．2．16 MβCD对细胞胆固醇、myriocin对细胞鞘磷脂降解情况

2．2．17 过表达viperin对细胞胆固醇和鞘磷脂的影响试验

2．3 结果

2．3．1 rRC-HL狂犬病病毒株的拯救

2．3．2 狂犬病病毒效价的测定

2．3．3 不同细胞对狂犬病病毒的易感性实验

2．3．4 狂犬病病毒感染不同细胞后viperin基因的差异表达

2．3．5 瞬时过表达viperin抑制狂犬病病毒的复制

2．3．6 稳定表达viperin抑制狂犬病病毒的复制

2．3．7 Viperin抑制狂犬病病毒复制能力与其蛋白表达量成正比

2．3．8 Viperin抑制狂犬病病毒的功能区定位

2．3．9 免疫共沉淀试验证实viperin不结合狂犬病病毒的N、P和M蛋白

2．3．10 过表达viperin抑制狂犬病病毒的出芽

2．3．11 Viperin对细胞膜鞘磷脂和胆固醇的影响

2．3．12 MβCD／Myroicin对狂犬病病毒吸附和穿入的影响

2．3．13 MβCD／Myroicin对狂犬病病毒出芽的影响

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 Viperin抑制狂犬病病毒复制受上游TLR3／4通路调控

3．1 材料

3．1．1 细胞／动物和病毒

3．1．2 主要的试剂

3．1．3 抗体

3．1．4 主要仪器

3．2 方法

3．2．1 细胞总RNA的提取

3．2．2 Real-time RT-PCR方法的建立

3．2．3 Western blot

3．2．4 免疫应答基因转录谱分析

3．2．5 流式细胞术分析RAW264．7细胞TLR4的表达情况

3．2．6 NF-κB、IRF3和TLR4的抑制试验

3．2．7 TLR3基因敲除的RAW264．7细胞系的建立

3．3 结果

3．3．1 狂犬病病毒感染RAW264．7细胞免疫应答基因转录普分析

3．3．2 TLR4对viperin的影响

3．3．3 TLR3对viperin的影响

3．3．4 狂犬病病毒感染对TLR3／4信号传导通路相关因子的影响

3．3．5 NF-κB信号通路对狂犬病病毒上调viperin的影响

3．3．6 狂犬病病毒上调viperin通过IRF3／Hsp90信号通路

3．3．7 狂犬病病毒与viperin相互作用示意图

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 结论

参考文献

附录

致谢

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