不同甘蔗品种抗旱性的生理和分子机制

摘要

甘蔗是重要的糖料作物，目前中国甘蔗生产的土地条件差，旱地甘蔗占了主要的生产面积，干旱缺水极大影响了中国甘蔗的生产以及制约了制糖业的持续合理发展。对甘蔗抗旱生理生化特性及分子机制进行深入的研究，对于选育抗旱性强的甘蔗品种以及旱地甘蔗抗旱栽培技术的研发都有重要的意义。本研究采用桶栽方式，对抗旱性有差异的F172（抗旱性较强）和YL6（不抗旱）两个甘蔗品种，在苗期及伸长期分别进行不同程度的干旱胁迫及复水处理，探讨了不同甘蔗品种抗旱性与各生理指标间的关系，同时运用蛋白质组学技术对这两个甘蔗品种在重度干旱胁迫下其叶片蛋白质的表达情况进行了分析比较，根据差异表达蛋白成功克隆了四个抗旱相关基因并进行了表达分析。获得如下主要的结果:
　　1.抗旱性较强的甘蔗品种F172在干旱胁迫条件下叶片中氧自由基清除酶系中的非可溶性蛋白(ISP)、可溶性糖(SS)、过氧化物酶(POD)和抗氧化保护酶过氧化氢酶(CAT)活性及超氧化物歧化酶(SOD)含量显著提高;与不抗旱甘蔗品种YL6相比，丙二醛(MDA)、非可溶性糖(ISS)含量相对比较稳定;而不抗旱甘蔗品种YL6在干旱胁迫条件下叶片中氧自由基清除酶反应较迟钝，MDA和ISS含量上升幅度相对较大，而可溶性蛋白(SP)、ISP含量下降。这些生理生化特性的差异表明了抗旱性不同的甘蔗品种在不同的生长阶段，抵御干旱胁迫过程中存在着差异。
　　2.利用双向电泳技术，研究了重度干旱胁迫下F172和YL6两个甘蔗品种苗期叶片蛋白质的差异表达情况。结果表明:经PDQuest软件对蛋白质2-DE图谱进行分析，分别找出了差异显著的蛋白点28、20个，这些蛋白有的呈现上调表达，有的呈现下调表达，还有部分是新增的蛋白点，这些蛋白点在两个甘蔗品种中表达各异。可见重度干旱胁迫时，抗旱性不同的这两个甘蔗品种的蛋白丰度变化存在显著差异。
　　3.通过质谱技术，研究了两个甘蔗品种的48个差异表达蛋白质点，并进行质谱鉴定和生物信息学分析，成功从YL6中鉴定出了18个蛋白点，从F172中鉴定出了14个。根据功能分类，这些蛋白可分为8类。其中对于YL6甘蔗品种，参与自由基清除的有2个，参与细胞生长和分裂的有1个，参与光合作用的有6个，参与基础代谢（包括能量代谢、碳代谢、氮代谢、次生代谢、糖代谢以及RNA加工等）的有6个，参与防卫反应的2个，未知功能蛋白1个。F172中参与自由基清除的1个，参与光合作用的2个，参与细胞生长和分裂的2个，参与基础代谢（包括糖代谢、能量代谢、氮代谢、次生代谢、碳代谢以及RNA加工等）的4个，参与信号转导的2个，参与蛋白加工的1个，未知功能蛋白2个。可见抗旱性不同的两个甘蔗品种在干旱胁迫下差异表达的蛋白类型差异较大，甘蔗应答干旱胁迫的机制是十分复杂的，它是一个从多水平、多系统来综合调控的过程。
　　4.利用RACE和同源克隆技术，克隆获得了甘蔗谷氨酰胺合成酶基因（SoGS1）、甘蔗磷酸丙糖异构酶基因(SoTPI)、甘蔗20S蛋白酶体α亚基基因(SoPAA)和甘蔗果糖1，6-二磷酸醛缩酶基因(SoFBA)四个基因的cDNA全长，同时利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析了它们在轻度干旱，中度干旱，重度干旱，复水后1d和复水后3d表达量的变化情况。SoGS1在不同抗旱性品种中其表达特性不一，在抗旱性较强的甘蔗品种F172中随着干旱时间的增加，其相对表达量不断增加，复水后其相对表达量仍维持在较高水平，而抗旱性较弱的YL6在干旱胁迫时其相对表达量表现出先升高后降低的变化特点，表达高峰出现在复水后3d时;水分胁迫处理时抗旱性强的甘蔗品种F172与抗旱性弱的甘蔗品种YL6的SoTPI的相对表达量变化趋势相仿，但F172在复水1d时迅速出现表达高峰，而YL6则在复水3d出现表达高峰;F172在水分胁迫时SoPAA相对表达量呈现出缓慢上升的趋势，在复水1d时其相对表达量达到最高，为对照的20倍左右，而YL6号在水分胁迫时相对表达量呈现出缓慢下降的趋势，在复水3d时其相对表达量达到最高;两个甘蔗品种在复水后SoFBA基因的相对表达量均出现大幅度的升高，可见SoFBA在甘蔗响应水分胁迫的过程中发挥了重要的作用。这些基因都对甘蔗水分胁迫有相应的应答反应，这些基因的功能各异，在参与水分胁迫过程中具有不同的防御途径。

目录

声明

摘要

英文缩略表

1 前言

1．1 植物水分胁迫的生理生化基础

1．1．1 水分胁迫与植物的渗透调节物质

1．1．2 水分胁迫与保护酶系统

1．1．3 水分胁迫与植物细胞膜系统

1．2 植物水分胁迫的分子生物学

1．2．1 植物水分胁迫与蛋白质组学

1．2．2 水分胁迫与抗旱基因

1．3 研究的目的和意义

2 干旱胁迫对不同甘蔗品种生理生化特性的影响

2．1 试验材料与测定方法

2．1．1 处理与采样

2．1．2 甘蔗逆境生理指标的测定

2．2．1 干旱胁迫及复水对不同生长期甘蔗叶片SOD的影响

2．2．2 干旱胁迫及复水对不同生长期甘蔗叶片POD的影响

2．2．3 干旱胁迫及复水对不同时期甘蔗叶片CAT活性的影响

2．2．4 干旱胁迫及复水对不同时期甘蔗叶片MDA含量的影响

2．2．5 干旱胁迫及复水对不同时期甘蔗叶片SP含量的影响

2．2．6 干旱胁迫及复水对不同时期甘蔗叶片ISP含量的影响

2．2．7 干旱胁迫及复水对不同时期甘蔗叶片SS含量的影响

2．2．8 干旱胁迫及复水对不同时期甘蔗叶片ISS含量的影响

2．3 结论

2．4 讨论

2．4．1 干旱胁迫及复水对甘蔗叶片SOD的影响

2．4．2 干旱胁迫及复水对甘蔗叶片POD的影响

2．4．3 干旱胁迫及复水对甘蔗叶片CAT的影响

2．4．5 干旱胁迫及复水对甘蔗叶片SP含量的影响

2．4．6 干旱胁迫及复水对甘蔗叶片ISP含量的影响

2．4．8 干旱胁迫及复水对甘蔗叶片ISS含量的影响

3 干旱胁迫对甘蔗幼苗叶片蛋白质表达的影响

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 材料的处理与采样

3．1．3 主要生化试剂

3．1．4 主要仪器设备

3．1．5 相关溶液的配置

3．1．6 叶片样品蛋白质的提取

3．1．8 双向凝胶电泳

3．1．9 染色

3．1．10 图像扫描及分析

3．1．11 差异蛋白点质谱鉴定分析

3．2 结果与分析

3．2．1 重度干旱胁迫时甘蔗幼苗叶片总蛋白的SDS-PAGE图

3．2．2 重度干旱胁迫下不同甘蔗幼苗叶片的蛋白质表达情况

3．2．3 差异表达蛋白的质谱鉴定

3．3 讨论

3．3．1 参与光合作用的相关蛋白

3．3．2 参与自由基清除的相关蛋白

3．3．3 参与代谢的相关蛋白

3．3．4 细胞生长和分裂相关蛋白

3．3．5 参与防卫反应的蛋白

3．3．6 参与蛋白加工相关蛋白

3．3．7 参与信号转导相关的蛋白

3．4 小结

4 甘蔗抗旱相关基因的克隆及表达分析

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 材料的处理

4．1．3 主要仪器与试剂

4．1．4 总RNA的提取

4．1．5 cDNA的合成

4．1．6 基因全长的获取

4．1．7 PCR产物的定性分析

4．1．8 克隆产物的测序及生物信息学分析

4．1．9 Real time PCR(qRT-PCR)反应体系及程序设置

4．2 结果与分析

4．2．1 甘蔗总RNA的提取及cDNA的合成

4．2．2 干旱胁迫应答相关基因的克隆及分析

4．3 讨论

4．3．1 甘蔗SoGS1基因

4．3．2 甘蔗SoTPI基因

4．3．3 甘蔗SoPAA基因

4．3．4 甘蔗SoFBA基因

5 结论

5．1 全文总结

5．2 论文创新点

5．3 展望

参考文献

致谢

附录