广西家蚕血液型脓病毒株囊膜糖蛋白GP64基因克隆和序列分析

摘要

广西是我国第一大蚕桑业生产基地，地处亚热带地区，气候条件优越，一年可养多批次蚕，但炎热多湿的环境也容易造成蚕病的流行和传播，特别是家蚕血液型脓病，一旦暴发，几乎无法控制，给蚕业生产带来严重的危害和损失。家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，简称BmNPV）是家蚕血液型脓病的病原，BmNPV的gp64基因编码的囊膜糖蛋白GP64对BmNPV在宿主昆虫体内的传播具有关键作用。掌握gp64基因的序列信息发生变异的准确位点，为进一步的蛋白功能研究奠定基础，另外，从分子水平上探索BmNPV的系统发育情况，有助于对BmNPV侵染机理的进一步研究，从而为广西家蚕血液型脓病的防控提供科学依据。本研究对广西不同蚕区采集的BmNPV分离株的gp64基因进行克隆测序以及序列分析，所得结果如下:
　　1、本研究对19株广西BmNPV分离株的gp64基因进行克隆和测序，获得完整的gp64基因ORF片断，有7株分离株的gp64基因ORF为1590bp，5株分离株的为1593bp，7株为1599bp。
　　2、进行gp64基因ORF核苷酸同源性分析，仅有1株分离株与T3株的核苷酸序列同源性达到100％，其余18株与T3株核苷酸同源性在98.5％～99.2％之间，编码氨基酸同源性在98.5～99.6％之间。19株广西分离株之间gp64基因ORF核苷酸同源性在98.4～100％之间，编码氨基酸的同源性在98.3～100％之间。
　　3、构建gp64基因的遗传进化树，19株广西BmNPV分离株可以分为两个亚群cladeⅠ和cladeⅡ，其中有11株属于cladeⅠ，8株属于cladeⅡ。cladeⅠ中的分离株在地理分布上相对较集中，cladeⅡ中的分离株在地理分布上较分散。
　　4、对BmNPV的gp64基因ORF进行单核苷酸多态性分析，结果表明，多数广西分离株的gp64基因ORF具有较多的突变位点，且gp64基因在密码子的使用上较为多变，不表现对某种密码子的偏好。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

1 前言

1．1 杆状病毒的分类

1．2 杆状病毒的表型和生活史

1．3 杆状病毒基因的四个表达时期

1．4 杆状病毒的基因组

1．4．1 杆状病毒基因组的研究概况

1．4．2 BmNPV基因研究现状

1．5 家蚕抗BmNPV相关蛋白和基因

1．6 杆状病毒囊膜糖蛋白GP64的研究现状

1．6．1 GP64蛋白的结构

1．6．2 GP64蛋白的功能

1．7 杆状病毒的应用

1．7．1 杆状病毒作为表达载体系统

1．7．2 杆状病毒作为表面展示系统

1．7．3 杆状病毒作为基因治疗载体

1．7．4 杆状病毒作为生物杀虫剂

1．8 本研究的目的意义及内容

2 材料与方法

2．1 生物材料

2．2 主要仪器

2．3 试剂和试剂盒

2．4 试验方法

2．4．1 BmNPV的扩增、收集和提纯

2．4．2 BmNPV多角体的镜检

2．4．3 BmNPV多角体的裂解和BmNPV基因组DNA的抽提

2．4．4 引物设计

2．4．5 PCR扩增目的基因

2．4．6 PCR产物电泳鉴定

2．4．7 PCR产物胶回收与纯化

2．4．8 目的基因的克隆

2．4．9 重组质粒的抽提

2．4．10 阳性克隆重组质粒的鉴定

2．4．11 目的基因测序和拼接

2．4．12 序列比对和进化树分析

3 结果与分析

3．1 BmNPV多角体的镜检结果

3．1．1 BmNPV多角体的光学显微镜镜检

3．1．2 BmNPV多角体的电镜镜检

3．2 BmNPV gp64基因扩增结果

3．3 重组质粒酶切鉴定结果

3．4 gp64基因测序与序列比对结果

3．4．1 gp64基因核昔酸序列的测序与比对

3．4．2 gp64基因进化树分析结果

3．4．3 gp64基因编码区单核苷酸多态性分析

4 讨论与结论

4．1 讨论

4．2 结论

致谢

参考文献

附录

攻读学位期间论文发表情况