木薯“西选03”再生体系建立及农杆菌介导遗传转化初探

摘要

广西是我国木薯种植第一大省，围绕木薯淀粉加工形成的一系列木薯加工产业链，是广西经济组成的重要部分。“西选03”是广西大学选育的木薯优良品种，耐旱、产量高，具有较高的经济和推广价值，采用转基因方法把抗逆基因导入优良木薯品种中可有效提高抗逆性，改良木薯品种。本试验主要研究以“西选03”幼嫩茎段腋芽为外植体建立快繁体系、以获得的无菌苗幼嫩叶片为材料建立离体叶片再生体系以及初步建立农杆菌介导的无菌叶片遗传转化体系，结果如下:
　　1.外植体灭菌:经过0.1％ KMnO4预处理10 min和75％酒精浸泡20 s后，大田栽培、室内水培、大棚沙培来源的外植体用0.1％ HgCl2分别灭菌10min、5 min、6min效果最好，污染率分别为30.8％、11.1％、17.1％，成活率分别可达61.5％、80.0％、74.4％。
　　2.初代培养:添加低浓度6-BA的培养基中外植体腋芽萌发优于KT和TDZ，最适宜初代诱导的培养基为MS+6-BA0.05 mg/L，外植体在一周内萌发，萌芽率达90.0％，萌发芽长势良好。
　　3.继代增殖:单芽增殖培养宜采用MS+6-BA0.1 mg/L培养基，芽增殖倍数可达4.6;密集丛生芽培养宜采用MS+6-BA0.3 mg/L+GA30.5 mg/L培养基;无菌芽壮苗培养宜采用MS+ PP3333.0 mg/L培养基，无菌芽节间缩短、增粗。
　　4.生根:单独添加NAA、PP333或者直接用MS培养基均可诱导无菌芽生根，其中以MS+PP3330.3 mg/L诱导生根效果较好，根短而粗壮，生根率达100％，平均根数6.9。
　　5.生根苗移栽:取生根3条左右，株高3～4 cm的健壮组培苗移栽至草炭∶蛭石∶菜园土=1∶1∶1的基质中，30 d成活率可达55.1％。
　　6.愈伤组织诱导:MS+毒莠定12 mg/L+CuSO40.5 mg/L适合作为无菌叶片愈伤组织诱导培养基，出愈率达100％。形成愈伤组织呈淡黄色，部分愈伤组织块表面有颗粒状突起。
　　7.愈伤组织继代:最佳的愈伤组织继代培养基为1/2MS+毒莠定12 mg/L，增殖率达86.7％，用此培养基继代，可使硬化愈伤组织块变得疏松，表面颗粒状突起明显，为转化成胚性愈伤组织做准备。
　　8.愈伤组织分化诱导:采用生长素类与细胞分裂素类植物生长调节剂配合使用诱导愈伤组织产生不定芽，分化率极低。采用MS+6-BA1.0 mg/L+ IAA0.5 mg/L+AgNO30.5 mg/L+CuSO40.5 mg/L培养基可一定程度上提高不定芽的分化率，但仍然不足15％。
　　9.抗生素筛选:分别对带腋芽茎段、无菌叶片和愈伤组织块进行抗生素Km耐受压筛选，结果表明，三种材料的抗生素选择压培养基分别为MS+6-BA0.05 mg/L+ Km400 mg/L、MS+毒莠定12 mg/L+ Km200 mg/L和MS+毒莠定12 mg/L+Km150 mg/L。
　　10.农杆菌侵染无菌叶及GFP基因荧光检测:农杆菌侵染无菌叶以20 min效果最好，GFP荧光表达率可达63.3％;农杆菌与无菌叶共培养4d效果较好，GFP荧光表达率为56.7％。

目录

声明

摘要

缩写词

1 前言

1．1 木薯的用途

1．1．1 加工淀粉及变性淀粉

1．1．2 加工酒精及衍生能源物

1．1．3 加工饲料及其他用途

1．2 国内外研究进展

1．2．1 木薯组织培养研究进展

1．2．2 转基因育种

1．3 选题背景及目的意义

1．3．1 选题背景

1．3．2 选题目的与意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 农杆菌菌株与质粒

2．1．3 主要组织培养试剂

2．1．4 培养基种类

2．2 试验方法

2．2．1 以带腋芽茎段为材料的木薯组织快繁体系的建立

2．2．2 以无菌叶片为材料建立再生体系

2．2．3 遗传转化体系的初步建立

2．3 培养条件

2．4 数据处理

3 结果分析

3．1 材料灭菌效果

3．1．1 0．1％HgCl2处理时间对灭菌效果的影响

3．1．2 取材时问及天气条件对灭菌效果的影响

3．1．3 75％酒精处理时间对大田栽培芽灭菌效果的影响

3．2 初代培养

3．2．1 6-BA浓度对初代诱导的影响

3．2．2 KT、TDZ对初代诱导的影响

3．3 继代增殖

3．3．1 6-BA浓度对芽继代增殖的影响

3．3．2 生长素类植物生长调节剂对芽继代增殖的影响

3．3．3 6-BA和NAA组合对芽继代增殖的影响

3．3．4 GA3对丛生芽增殖的影响

3．4 壮苗

3．4．1 不同生长素类植物调节剂对无菌芽壮苗率的影响

3．4．2 6-BA与AC配合对壮苗率的影响

3．4．3 PP333对壮苗的影响

3．5 生根诱导

3．5．1 NAA对生根的影响

3．5．2 PP333对无菌芽生根的影响

3．6 试管苗移栽

3．6．1 移栽基质对移栽成活率的影响

3．6．2 不同品质试管苗对移栽成活率的影响

3．7 叶片愈伤组织诱导

3．7．1 2，4-D对愈伤组织诱导的影响

3．7．2 毒莠定对愈伤组织诱导的影响

3．7．3 NAA对叶片愈伤组织诱导的影响

3．8 愈伤组织增殖培养

3．9 愈伤组织分化

3．9．1 NAA、IBA、NAA对愈伤组织分化的影响

3．9．2 6-BA、KT、TDZ对愈伤组织分化的影响

3．9．3 AgNO3、CuSO4对愈伤组织分化的影响

3．10 抗生素选择压初步筛选

3．11 侵染时间、共培养天数对侵染率的影响

4 结论

4．1 以腋芽为外植体的再生体系

4．2 以无菌叶片为材料的再生体系

4．3 遗传转化体系的初步建立

5 讨论

5．1 讨论

5．1．1 木薯外植体的灭菌

5．1．2 无菌苗初代诱导及增殖培养

5．1．3 无菌苗壮苗及生根培养

5．1．4 无菌苗移栽

5．1．5 以叶片为材料的再生体系建立

5．1．6 农杆菌介导遗传转化

5．2 课题的创新之处

6 展望

致谢

参考文献

附图

攻读学位期间发表论文情况