十字花科黑腐病菌一对假定的双组份信号转导系统基因的功能研究

摘要

十字花科黑腐病菌，学名野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris，简称Xcc)，是一种能在世界范围内引起十字花科植物产生黑腐病的革兰氏阴性病原菌，也是研究植物与微生物相互作用的模式细菌之一。双组份信号转导系统(Two-component signaltransduction systems，简称TCSs)是微生物感受外界信号的最重要的信号传导系统。典型的双组份信号转导系统由两部份构成，其中一部份主要是感受外界环境刺激的组氨酸激酶感受蛋白(histidine kinase，HK);另一部份是执行着调控下游基因表达的作用的响应调节蛋白(response-regulatorprotein，RR)。基因组分析表明，Xcc8004共有111个双组份信号转导系统基因，目前仍有很多双组份信号转导系统基因的功能还不清楚，包括XC3067和XC3068这对推测的双组份信号调控系统基因。生物信息学分析表明，XC3067和XC3068在Xcc8004基因组上相邻，转录方向一致，两个基因间重叠14 bp，XC3067编码一个杂合双组份系统响应调节蛋白，XC3068编码一个双组份系统的感受蛋白。在前期的研究中发现，XC3068基因的Tn5gusA5的插入突变体与致病相关，为了进一步研究XC3067和XC3068这对双组份信号转导系统的生物学功能，利用同源双交换的策略，分别构建了XC3067和XC3068的缺失突变体DM3067和DM3068，及双缺失突变体DM3067/3068。测定生长曲线实验结果显示，与野生型菌株相比，突变体DM3067、DM3068和DM3067/3068在基本培养基和丰富培养基中的生长没有变化;致病生化因子检测实验结果显示，与野生型菌株相比，突变体DM3067、DM3068和DM3067/3068的胞外多糖、胞外蛋白酶、胞外淀粉酶和胞外纤维素酶和游动性等均没有显著差异;抗逆性检测实验结果显示，与野生型菌株相比，DM3067、DM3068和DM3067/3068耐受蛋白质变性剂的能力下降，渗透压抗性和有机溶剂抗性没有变化;在寄主满身红萝卜的致病性检测实验结果表明，与野生型菌株相比，突变体DM3068和DM3067/3068的致病力有显著变化;在非寄主辣椒上的过敏反应实验检测结果表明，与野生型菌株相比，突变体DM3067和DM3068的过敏反应减弱。DM3067和DM3068的反式互补菌能基本回复表型至野生型水平，表明XC3068与致病性相关，而XC3067和XC3068与过敏反应和蛋白质变性剂抗性相关。RT-PCR实验结果表明，XC3067和XC3068位于同一转录单元，很可能组成一个双组份信号转导系统。RT-PCR实验结果还表明，XC3067和XC3068在MMX的表达量与在NYGB中的表达量一致，在MMX条件下中不受hrpG和hrpX调控。
　　本研究结果显示XC3067和XC3068这对推测的双组份信号转导系统基因可能与野生型的致病力、过敏反应和蛋白质变性剂抗性相关。并且XC3067和XC3068位于同一转录单元，不被MMX诱导表达，不被hrpG和hrpX在MMX培养基条件下调控。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 双组份信号转导系统的相关进展

1．1．1 双组份信号转导系统的简介与分布

1．1．2 双组份信号转导系统中HKs的功能域

1．1．3 双组份信号转导系统中RRs的功能域

1．1．4 双组份信号转导系统的通路

1．2 十字花科黑腐病菌研究进展

1．2．1 十字花科黑腐病菌概述

1．2．2 双组份信号转导系统在8004中的研究进展

1．3 本研究的主要目的、内容和意义

1．3．1 本研究的主要内容

1．3．2 本研究的主要目的和意义

第二章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 应试植株

2．1．2 应试菌株

2．2 常规微生物学操作

2．2．1 细菌培养基

2．2．2 菌株的培养

2．2．3 菌株的保存

2．2．4 常用试剂与缓冲液

2．2．5 突变体营养缺陷型检测

2．2．6 胞外多糖的检测

2．2．7 胞外酶的检测

2．2．8 细菌游动性的检测

2．2．9 抗逆性的检测

2．2．10 生长曲线的测定

2．3 分子生物学操作技术

2．3．1 十字花科黑腐病菌基因组DNA提取

2．3．2 细菌质粒的提取

2．3．3 DNA的分子生物学操作

2．3．4 聚合酶链式反应(PCR)

2．3．5 RNA的分子生物学操作

2．3．7 细菌的感受态细胞制备与转化接合实验

2．3．8 三亲本接合实验

2．3．9 缺失突变体的构建与互补

2．4 植株实验

2．4．1 致病性实验

2．4．2 过敏反应实验

第三章 结果与分析

3．1 生物信息学分析

3．1．1 基因XC3067与XC3068的基本特征和结构域分析

3．1．2 XC3067与XC3068蛋白质序列比对

3．1．3 小结

3．2 缺失突变体的构建

3．2．1 重组质粒的构建

3．2．2 缺失突变体的验证结果

3．2．3 小结

3．3 反式互补菌株的构建

3．3．1 重组质粒的构建

3．3．2 互补菌株的验证结果

3．3．3 小结

3．4 突变体的生理生化表型检测结果

3．4．1 营养缺陷性检测结果

3．4．2 在MMX和NYG培养条件下生长曲线的测定结果

3．4．3 胞外多糖的检测结果

3．4．4 胞外纤维素酶的检测结果

3．4．5 胞外淀粉酶的检测结果

3．4．6 胞外蛋白酶的检测结果

3．4．7 游动性的检测结果

3．4．8 胁迫实验结果

3．4．9 小结

3．5 植株实验结果

3．5．1 致病力检测结果

3．5．2 过敏性实验结果

3．5．3 小结

3．6 XC3067与XC3068的表达与调控关系

3．6．1 总RNA的提取

3．6．2 RNA的消化

3．6．3 共转录验证结果

3．6．4 基因间的调控关系结果

3．6．5 小结

第四章 讨论与结论

4．1 讨论

4．1．1 突变体DM3067与DM3068不是营养缺陷型

4．1．2 基因XC3067与XC3068不影响8004的生长

4．1．3 基因XC3067与XC3068不影响大多数致病生化因子

4．1．4 基因XC3067与XC3068影响蛋白质变性剂的耐受程度

4．1．5 基因XC3068与致病性相关，基因XC3067和XC3068与过敏反应相关

4．1．6 基因XC3067与XC3068位于同一转录单元，共用一个启动子

4．1．7 初步判断基因XC3067与XC3068是一对双组份信号转导系统基因

4．2 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况