黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)生物膜的形成及相关基因功能分析

摘要

黄瓜枯萎病(Cucumber Fusarium Wilt)是黄瓜生产上严重的土传真菌病害。这种土传真菌能够在各种不同类型的土壤中存活并导致植株发病，病害一旦发生，往往会给黄瓜的质量与产量造成严重的损失。黄瓜枯萎病菌是尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)。关于尖孢镰刀菌的致病机理方面已有很多报道，主要包括导管堵塞假说、毒素作用假说、细胞壁降解等。但是由于对病原菌生物学特性认知的局限性，目前的研究还没有完全阐明黄瓜枯萎病菌的致病机理，因此对黄瓜枯萎病的防治仍然没有非常行之有效的措施。
　　生物膜(biofilm)是微生物聚集在一起，附着在生物或者非生物的表面，并包埋在自身分泌的胞外物质里，与浮游状态相对的一种存在形式。生物膜的形成是人体、动物病原菌致病的关键因素。受人体角膜炎病原菌（Fusarium oxysporum）能够形成生物膜并参与致病的启发，本研究探索黄瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.cucumerinum)Foc-GD生物膜的形成与致病性的关系。主要开展生物膜形成条件的摸索、生物膜特性的分析、生物膜调控基因的挖掘及功能验证等方面的研究。主要取得以下结果:
　　1、黄瓜枯萎病菌Foc-GD生物膜的形成方法及条件。研究发现，用RPMI1640培养基重悬黄瓜枯萎病菌Foc-GD孢子至106 cfu/mL，将200μL标准的孢子悬浮液添加至平底96孔聚苯乙烯细胞培养板的每孔内，将细胞培养板置于28℃培养箱内静置培养2h,用微量洗涤器将培养基及没有黏附到培养板的孢子轻轻吸取，用PBS轻柔地漂洗两次，最后粘附在细胞培养板表面的是生物膜的初始菌落，然后添加200μL RPMI1640培养基于细胞培养板每个孔内继续静置培养48h，至生物膜成熟。采用XTT(3，3'-[1-(苯氨酰基)-3，4-四氮唑]-二（4-甲氧基-6-硝基）苯磺酸钠）减低法对生物膜进行半定量测定。结果显示，黄瓜枯萎病菌生物膜形成与培养基pH值、碳源和培养温度有关。生物膜形成最适温度是28℃，最适pH环境为微酸和中性环境(pH5～7)，葡萄糖为碳源的培养基中能够形成生物膜。
　　2、病原菌Foc-GD生物膜特性分析。黄瓜枯萎病菌形成的生物膜用荧光染料染色后，借助激光共聚焦显微镜观察生物膜微观结构。研究发现Foc-GD形成的成熟生物膜由浓密的菌丝细胞和胞外多糖分泌物组成，菌丝细胞与胞外多糖物质紧密排列，形成质地均一的复合体。
　　成熟生物膜与浮游孢子相比，表现出对外界环境压力不敏感型。研究发现，在45℃的亚致死温度下，处理30 min和min，成熟生物膜的代谢活动无明显影响，而浮游孢子代谢活动分别降低了62.25％和86.29％。成熟生物膜与浮游孢子在-20℃，-10℃，4℃下处理24h，浮游孢子与成熟生物膜在4℃下代谢活动没有明显差异，而-20℃，-10℃的低温对成熟生物膜的影响明显小于对浮游孢子的影响。样品在紫外线下处理20min，30min后，成熟生物膜分别下降了29.18％、43.11％，而浮游孢子却下降了52.29％、90.23％。用6.4μg/mL的多菌灵、咪酰胺、丙环唑分别处理样品24h之后，成熟生物膜的代谢活动分别下降了33.8％、39.2％和26.6％，而浮游孢子分别下降了76.5％、73.2％、50.7％。
　　3、病原菌Foc-GD丝绒蛋白基因FocVel1的克隆与表达。研究表明，丝绒蛋白FocVel1(GenBank: KJ716229)编码532个氨基酸，最大开放阅读框为1596bp,含有1个94bp的内含子。将FocVel1氨基酸序列比对，分别与Ffujikuroi的FfVel1(GenBank:FN548142),F.verticillioides的FvVe1(GenBank:DQ274059),F graminearum的FgVEAfrom(GenBank: JN635273)具有97.56％，97.74％，78.29％的相似性。
　　借助实时荧光定量PCR分析Foc Vel1在野生型Foc-GD菌丝发育的24，36，48，60，72h表达情况。FocVel1在菌丝发育的24和36h，表达量较低(p＜0.05）;在48h，达到高峰，在60和72h，表达量相对降低并稳定保持较高水平(P＜0.05）。Foc Vel1的表达结果与文献报道黄瓜枯萎病菌分生孢子梗在48h之后增殖的结果是一致的。
　　4、黄瓜枯萎病原菌丝绒蛋白基因Foc Vel1的功能验证。利用基因敲除与回补的方法研究Foc Vel1的功能。研究发现，丝绒蛋白Foc Vel1基因具有调控病原菌孢子发育、菌丝生长、细胞壁组分、生物膜形成与致病性的作用。用马铃薯葡萄糖(PDA)培养基培养菌株，Foc Vel1敲除突变体⊿Foc Vel1-3产孢量远远小于野生型菌株Foc-GD和回补突变体⊿FocVel1-3C(p＜0.05)，⊿Foc Vel1-3菌落生长明显变慢，气生菌丝变少变短，并且菌丝分支明显增多。分别用1.0 M KCl、1.0 M山梨醇、16μg/mL异菌脲、0.2μg/mL咪鲜胺、48μg/mL恶霉灵、0.05％刚果红、5 mM咖啡碱添加至培养基，研究菌落对渗透压力与细胞破坏剂的敏感性。研究发现，⊿Foc Vel1-3对1.0 M KCl、1.0M山梨醇、0.05％刚果红、5 mM咖啡碱的敏感性下降(p＜0.05)，对16μg/mL异菌脲、0.2μg/mL咪鲜胺的敏感性上升(p＜0.05），结果表明Focvel1可能与细胞壁的组成、细胞壁的完整性有关。
　　生物膜形成比较发现，在聚苯乙烯片上，突变体⊿FocVel1-3孢子在聚苯乙烯板上的聚集减少，而且孢子萌发和菌丝的生长延迟，⊿FocVel1-3形成的生物膜比较稀薄，比较松散，菌丝与胞外物质分布不均。XTT半定量法测定显示野生型Foc-GD和回补型菌株⊿FocVel1-3C成膜的量分别是基因敲除突变菌株⊿FocVel1-3的1.23，1.52，1.69，2.56倍。
　　用突变体⊿FocVel1-3与野生型Foc-GD、回补型⊿FocVel1-3C接种黄瓜苗，15天后，接种野生型Foc-GD和回补型⊿FocVel1-3C的黄瓜苗逐渐发病并枯萎死亡，病情指数DSI分别为93.7和92.3，而接种FocVell基因敲除突变菌株⊿FocVel1-3的黄瓜苗发病率明显下降，多数黄瓜苗只出现轻微黄化症状，病情指数DSI为37.3(p＜0.05)。结果表明FocVel1基因与黄瓜枯萎病菌Foxysporumf.sp.cucumerinum生物膜形成及致病力有关。
　　5、黄瓜枯萎病菌转化GFP载体。借助激光共聚焦显微镜观察到在接种病原菌孢子悬浮液24h后，孢子不断萌发并粘附到黄瓜苗侧根的表面，随着接种时间的延长，病原菌逐渐刺穿侧根表皮，进入表皮细胞。侵染进展期，病原菌侵入主根表皮，并不断向维管束部分侵染，接种120h之后，即侵染后期，病原菌占据主根维管束部位，菌丝逐渐密集成交错菌丝网。
　　本研究中黄瓜枯萎病菌Foc-GD FocVel1基因敲除后，生物膜的形成受损，致病力下降，表明生物膜的形成是植物病原真菌重要的致病因子，该研究结果为揭示黄瓜枯萎病的致病机理提供新思路，对黄瓜枯萎病的综合防控提供理论支持。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 尖孢镰刀菌概述

1．2 黄瓜枯萎病(F．oxyspoum f．sp．cucumerinum)概述

1．2．1 黄瓜枯萎病的症状

1．2．2 黄瓜枯萎病的病原

1．2．3 黄瓜枯萎病的侵染循环

1．2．4 黄瓜枯萎病的防治

1．3 尖孢镰刀菌致病机理

1．3．1 导管堵塞假说

1．3．2 毒素作用假说

1．3．3 信号传导系统

1．3．4 细胞壁降解

1．3．5 克服植物的防御系统

1．4 生物膜概述

1．4．1 生物膜定义

1．4．3 生物膜形成影响因素

1．4．4 真菌生物膜

1．4．5 丝状真菌生物膜

1．4．6 丝状真菌的群体感应

1．4．7 生物膜的模型

1．4．8 生物膜与农业生产

1．4．9 生物膜耐受性

1．5 丝绒蛋白

1．6 丝状真菌基因敲除

1．7 本研究的目的与意义

第二章 病原菌生物膜的形成及敏感性分析

2．1 材料与方法

2．1．1 供试菌株

2．1．2 供试培养基

2．1．3 溶液的配制

2．1．4 供试试剂与药剂

2．1．5 生物膜的形成

2．1．6 环境因素对Foc-GD形成生物膜的影响

2．1．7 Foc-GD对环境压力的敏感性分析

2．1．8 Foc-GD生物膜结构的观察

2．2 结果与分析

2．2．1 Foc-GD生物膜的发育

2．2．2 Foc-GD生物膜形成的物理影响因素

2．2．3 Foc-GD生物膜与浮游孢子对环境压力的敏感性

2．2．4 F．oxysporum f．sp．cucumerinum生物膜结构

2．3 讨论

第三章 丝绒蛋白对黄瓜枯萎病菌生物膜形成的调控

3．1 材料与方法

3．1．1 供试菌株

3．1．2 供试培养基及培养条件

3．1．3 丝绒蛋白基因生物信息学分析

3．1．4 丝绒蛋白FocVell基因的克隆

3．1．5 丝绒蛋白FocVell基因的表达

3．1．6 FocVell基因的敲除及回补

3．1．7 生物膜特征的比较

3．1．8 显微观察

3．1．9 致病性分析

3．1．10 数据统计

3．2 结果与分析

3．2．1 FocVell的基因信息分析

3．2．2 FocVell的表达

3．2．3 FocVell的基因敲除与回补

3．2．4 产孢量比较

3．2．5 菌落形态比较

3．2．6 对渗透压力和细胞破坏因子的敏感性

3．2．7 对生物膜发育的影响

3．2．8 对成熟生物膜结构的影响

3．2．9 致病性分折

3．3 讨论

第四章 黄瓜枯萎病菌在植株体内的生物膜的形成

4．1 材料与方法

4．1．1 供试菌株与载体

4．1．2 培养基及试剂配制

4．1．3 大肠杆菌DH5α转化

4．1．4 基因组DNA提取

4．1．5 转化菌株PCR验证

4．1．6 转化菌株Southern blot杂交验证

4．1．7 质粒提取

4．1．8 原生质体的制备及转化

4．1．9 原生质体对潮霉素的浓度筛选

4．1．10 转化株荧光遗传稳定性鉴定

4．1．11 生长速度及致病力比较

4．2 结果与分析

4．2．1 潮霉素浓度筛选

4．2．2 转化菌株荧光稳定性观察

4．2．3 转化菌株验证

4．2．4 生长速度及致病力比较

4．2．5 显微观察

4．3 讨论

第五章 总结

5．1 全文总结

5．2 论文的创新点

5．3 问题与展望

参考文献

致谢

作者在攻读博士学位期间科研、学术活动、论文发表和专利发明等情况

论文说明