广西凡纳滨对虾白斑综合征病毒的检测及结构蛋白VP24和VP51的克隆与表达

摘要

对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)是引起对虾病毒性疾病最主要的病毒之一，其传染性强，宿主分布广泛，可造成对虾养殖业巨大的经济损失。然而迄今为止，对该病毒尚没有有效的治疗措施，因此早期检测和诊断来筛选健康对虾群体、建立有效的预防监控系统、早切断传播途径成为现今防治该病的有效途径。结构蛋白是病毒结构与功能的体现者，是使动物机体发生各种毒性反应的主要成分。WSSV结构蛋白导入虾体，能提高虾体抵抗WSSV的能力。本研究用GB套式PCR法对广西沿海各地凡纳滨对虾进行WSSV检测，快速有效的了解广西沿海各对虾养殖场中凡纳滨对虾WSSV的携带情况，为凡纳滨对虾养殖提供理论参考。并成功克隆表达了蛋白VP24和VP51，为下一步蛋白纯化、抗体制备及重组蛋白性质和功能的研究，为研发一种全新的提高对虾特异性免疫水平的方法、制备一种亚疫苗制剂以达到预防WSSV感染的目的打下了基础。主要结果为:
　　1、通过比较一步法PCR和套式PCR的检测结果，确定了GB套式PCR方法为检测WSSV的最优方法，并运用此方法对2013-2014年广西区内3个市下的8个县区（北海市市区、北海市铁山港区、北海市合浦县、钦州市市区、钦州市钦南区、防城港市防城区、防城港市港口区和防城港市东兴）共462份凡纳滨对虾样品（幼虾/成虾、虾苗/仔虾）进行WSSV感染情况调查。结果显示，WSSV总阳性数为83份，总阳性率17.97％。其中北海市市区对虾WSSV携带率最高，为43.59％。除北海市铁山港区没有检测到WSSV，其余县市均检测到阳性样品。幼虾/成虾的WSSV阳性率29.41％，虾苗/仔虾的WSSV阳性率5.80％，明显低于幼虾/成虾的携带率。2013年虾的总阳性率为20.19％，2014年虾的总阳性率为13.10％，WSSV携带率有所下降。
　　2、利用DNAStar软件对WSSV为阳性的7个县区的虾样品各选取1株进行核苷酸序列分析，结果发现7株广西分离株WSSV核苷酸同源性为96.8-99.4％;与Genbank上已知序列比对，发现广西分离株与印度株(JN165706.1)核苷酸同源性最高，达到了99.8-100％。构建基因遗传进化树，结果显示7株广西分离株同在一个大分支，种属的序列差异小，表明广西WSSV分离株没有明显的时间和地域差异，且与国外参考标准株亲缘关系也很近(96.8-100％)。
　　3、PCR扩增得到vp24和vp51基因，并分别进行了克隆，获得重组质粒pMD18-T-vp24和pMD18-T-vp51，测序和双酶切检测显示克隆成功。构建重组表达载体pET-His-VP24和pET-His-VP51，并转化大肠杆菌BL21感受态细胞，加IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE电泳，结果表明有与预期大小23 kDa和29 kDa相符合的目的条带，目的蛋白初步确定成功表达。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 文献综述

1．1 引言

1．2 WSSV的病原学

1．2．1 WSSV的命名和分类地位

1．2．2 WSSV的形态结构

1．2．3 WSSV的基因组结构

1．2．4 WSSV的结构蛋白

1．3 WSSV的流行病学

1．3．1 WSSV的宿主范围

1．3．2 WSSV的传播途径

1．4 白斑综合征(WSD)病症

1．5 WSSV的检测方法

1．5．1 目视检查法

1．5．2 病理学方法

1．5．3 免疫学检测法

1．5．4 分子生物学检测法

1．6 WSSV的防治措施

1．7 本研究的目的和意义

2 对虾白斑综合征病毒(WSSV)PCR检测方法的确定

2．1 试验材料

2．1．1 对虾及病毒样品

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．2 试验方法

2．2．1 虾样处理

2．2．2 对虾基因组DNA的提取

2．2．3 套式PCR扩增

2．2．4 PCR产物的凝胶电泳和测序

2．2．5 结果判定

2．3 结果与分析

2．3．1 WSSV的PCR扩增结果

2．3．2 样品测序分析

2．3．3 一扩和二扩的结果比较

2．4 讨论

3 广西区内凡纳滨对虾WSSV携带情况调查

3．1 材料与试剂

3．1．1 虾样来源

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器

3．2 方法

3．2．1 虾样采集

3．2．2 虾样处理

3．2．3 DNA的提取

3．2．4 PCR反应

3．2．5 电泳

3．2．6 测序

3．3 结果与分析

3．3．1 不同养殖区对虾WSSV的检测结果

3．3．2 不同生长阶段养殖对虾WSSV的携带情况

3．3．3 不同年份采集的养殖对虾WSSV的携带情况

3．3．4 不同地区WSSV的分子遗传学比较

3．4 讨论

4 凡纳滨对虾WSSV结构蛋白VP24和VP51的克隆与表达

4．1 材料与试剂

4．1．1 实验样品

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要溶液配制

4．1．4 主要仪器

4．2 试验方法

4．2．1 WSSV的DNA提取

4．2．2 PCR扩增vp24和vp51基因

4．2．3 vp24和vp51基因的克隆

4．2．4 重组表达载体的构建

4．2．5 表达产物SDS-PAGE电泳

4．3 结果与分析

4．3．1 vp24基因的克隆与鉴定

4．3．2 vp51基因的克隆与鉴定

4．3．3 vp24与vp51表达载体的构建和鉴定

4．4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况