甘蔗Rubisco和PEPC基因的克隆及其在不同施氮水平下不同甘蔗品种中的表达

摘要

甘蔗（Saccharrum spp.）是一种重要的C4作物，在我国90％以上食糖年产量来自甘蔗。近年来，中国的甘蔗产业面临着许多新的挑战，过量施肥是其中之一。氮肥施用过量是国内蔗区极为普遍的现象，施氮过量不仅导致氮利用效率下降，增加了生产成本，加重病虫害，降低甘蔗蔗糖分，还会严重污染环境。光合酶Rubisco和PEPC是催化C4植物光合作用的关键酶，是植物叶片可溶性蛋白的主要组成成分，因此氮能够通过影响这两个酶的含量和酶学特性来影响光合作用。虽然关于氮对光合作用影响的研究已有不少，但是氮对不同氮利用效率甘蔗品种光合作用影响的分子水平的研究鲜有报道。光合作用与氮素利用密切相关，研究不同施氮量对不同氮利用效率甘蔗品种光合作用的影响，阐明氮利用效率与光合作用互作的机理对提高氮肥的利用效率有重要意义。
　　本研究采用PCR技术扩增甘蔗品种GT11的光合酶Rubisco和PEPC基因的全长CDS序列，并进行克隆、原核表达及纯化。采用荧光定量和Westernblotting技术对三个生长于不同施氮水平下的氮利用效率不同的甘蔗品种(GT11、ROC22和GXB9)的光合酶基因表达情况进行检测，同时测定光合作用，所得结果如下:
　　1.成功克隆出GT11的光合酶基因rbcS、rbcL和pepc的全长CDS，并在原核表达宿主Rosetta中进行表达，最终获得了符合单克隆抗体制备条件的融合蛋白SSU和LSU。
　　2.通过对荧光定量和Western blotting结果进行分析发现，氮利用效率高的甘蔗品种GXB9的三个光合酶基因在转录和蛋白质水平上表达量均比较稳定，ROC22次之，而氮利用效率最低的甘蔗品种GT11基因表达波动最为剧烈。实验还发现施氮处理主要通过影响rbcS的表达来影响甘蔗的光合作用。
　　3.对叶片中光合酶蛋白的Western blotting检测发现LSU在10月份时部分被降解为略小于全长的肽段，这可能与甘蔗进入成熟期净光合速率降低有关。
　　4.在本研究条件下，施氮处理对甘蔗光合速率有明显的影响，虽然中氮处理和高氮处理的净光合速率相差不大，但都显著高于低氮处理。荧光定量PCR和Western blotting分析结果表明:氮主要通过影响rbcS基因的表达来影响Rubisco全酶含量。

目录

声明

摘要

缩写表 Abbreviation

1 前言

1．1 研究背景

1．2 光合作用

1．2．1 Rubisco

1．2．2 C4-PEPC

1．3 氮对光合作用的影响

1．4 本研究的目的意义

1．5 技术路线

2 甘蔗Rubisco、C4-PEPC基因的克隆

2．1 材料和设备

2．1．1 试验材料

2．1．2 菌种和载体

2．1．3 试验试剂

2．1．4 主要仪器设备

2．1．5 主要试剂的配制

2．2 方法

2．2．1 克隆引物设计

2．2．2 DNA和RNA提取

2．2．3目的基因完整CDS的克隆

2．2．4 构建重组载体

2．2．5 制备DH5α感受态

2．2．6 重组质粒转化

2．2．7 阳性克隆的鉴定

2．3 结果与分析

2．3．1 DNA和RNA提取

2．3．2目的基因完整CDS的PCR扩增

2．3．3 重组质粒的验证

2．3．4 所得CDS序列分析

2．4 讨论

2．5 小结

3 克隆基因rbcs、rbcL和C4-pepc的原核表达及纯化

3．1 材料和设备

3．1．1 菌种

3．1．2 试验试剂

3．1．3 主要仪器设备

3．1．4 主要试剂的配制

3．2 方法

3．2．1 原核表达菌株Rosetta感受态的制备

3．2．2 重组质粒转化

3．2．3 融合蛋白的诱导表达

3．2．4 包涵体的溶解

3．2．5 融合蛋白的纯化

3．3 结果与分析

3．3．1 融合蛋白的诱导表达

3．3．2 表达条件的优化

3．3．3 融合蛋白的纯化

3．3．4 融合蛋白的浓缩

3．4 讨论

3．5 小结

4 不同施氮水平处理下甘蔗Rubisco、C4-PEPC基因的表达分析

4．1 材料和设备

4．1．1 材料

4．1．2 试验试剂

4．1．3 主要仪器设备

4．1．4 主要试剂的配制

4．2 方法

4．2．1 材料处理

4．2．2 样品采集

4．2．3 RNA提取

4．2．4 荧光定量引物的设计与筛选

4．2．5 RNA反转录

4．2．6 Real-time PCR

4．2．7 蛋白质提取

4．2．8 Western blotting

4．2．9 光合速率测定

4．2．10 数据分析

4．3 结果与分析

4．3．1 叶片RNA提取

4．3．2 荧光定量引物的筛选

4．3．3 Real-time PCR分析Rubisco、C4-PEPC基因的转录情况

4．3．4 叶片蛋白质提取

4．3．5 Western blotting条件优化

4．3．6 Western blotting检测Rubisco、C4-PEPC蛋白的表达

4．3．7 施氮对净光合速率的影响

4．4 讨论

4．4．1 施氮对甘蔗光合酶基因转录的影响

4．4．2 施氮对甘蔗光合酶蛋白表达的影响

4．4．3 施氮对甘蔗净光合速率的影响

4．4．4 不同施氮量对甘蔗光合作用的影响

4．5 小结

5 结论

5．1 全文总结

5．2 论文创新点

6 展望

参考文献

致谢

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