基于iTRAQ技术的罗非鱼脂肪肝差异蛋白质组学研究

摘要

目的:在罗非鱼饲养阶段中脂肪肝病频频发生，极大的阻碍了罗非鱼养殖业的发展步伐，本实验通过增加日投饲率建立罗非鱼脂肪肝病模型，应用iTRAQ联合多维液相色谱串联质谱技术(LC-MS/MS)筛选和鉴定健康罗非鱼与脂肪肝病罗非鱼之间的肝脏差异表达蛋白，深入分析肝脏脂肪病变过程中各差异蛋白对脂类代谢的影响，为检测与防治罗非鱼脂肪肝建立新思路。
　　方法:根据前期研究，设计实验组B日投饲率为体重10％，对照组A为6％，饲养八周后通过检测肝指数、肝脂含量、相关肝生化指标和肝组织切片验证罗非鱼脂肪肝病模型的建立。每组取36尾鱼，将36份肝脏样品等量混合为一组，经蛋白酶切后用iTRAQ试剂标记;应用LC-MS/MS技术分离肝脏蛋白，并用软件ProteinPilotTM Software5.0(AB Sciex)进行蛋白质数据检索，得到可信的具有定量信息的蛋白，在错误发现率(falsediscovery rate) FDR＜0.01的基础上，设定两组间表达量比值Ratio(B/A)＞1.3或Ratio(B/A)＜0.77为筛选差异表达蛋白上调或下调的阈值，将筛选到的差异蛋白进行GO分类注释、KEGG Pathway分析，在上述分析结果的基础上结合查阅文献筛选得到与脂肪肝形成相关的目的蛋白。
　　结果:1.3倍作为阈值筛选共获得差异蛋白166个，其中上调蛋白78个，1.3倍下调蛋白88个;这些蛋白参与了转运、小分子代谢、碳水化合物代谢、脂质代谢、脂质结合、生物合成、分解代谢、应激反应等37个生物过程，其中与脂肪肝病变密切相关的目的蛋白有29个，其中上调蛋白有RAC1（C3相关肉毒素基质）、ATP-柠檬酸合成酶、丙酮酸脱氢酶复合体的乙酰转移酶的组成部分、L-FABP（肝脏型脂肪酸结合蛋白）、脂滴包被蛋白家族成员2(ADRP)、SOD（超氧化物歧化酶）、ACSL（长链脂酰CoA合成酶）、Trx（硫氧还蛋白）、ICDH（异柠檬酸脱氢酶）、GP（α-1.4葡聚糖磷酸化酶）、GLUT2（易化性单糖转运家族成员2）、GST（谷胱甘肽s-转移酶A型）和线粒体多功能酶亚基α(HADHA);下调的蛋白有COX4（细胞色素氧化酶4）、细胞质HMG CoA合成酶、HL（肝酯酶）、CYP7A1（7-α-胆固醇单氧酶）、APOA4b（载脂蛋白A4b）、APOA4a(载脂蛋白A4a)、APOB100（载脂蛋白B-100）、LCP（瘦素受体蛋白）、CLU（丛集素）、CYP51（羊毛甾醇14α-去甲基化酶）、SPARC蛋白、VTG（卵黄蛋白原;卵黄生成素）、补体B、补体C5、FPPS（法尼基焦磷酸合成酶X1）以及ABCB11(ATP结合盒转运体B11)。
　　结论:通过GO、KEGG Pathway分析可知脂肪肝模型组与对照组的29个目的蛋白，其表达水平的上调或下调分别促进了肝脏脂肪合成、抑制了脂肪分解、阻塞了肝脏脂类外运途径、引发了肝脏组织炎症反应以及诱导了机体胰岛素抵抗，加速了模型组的肝脏脂肪肝病变。本研究从蛋白质水平揭示了脂肪肝发病机制，为治疗脂肪肝病提供新思路新靶点。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 我国罗非鱼产业发展概述

1．2 鱼类脂肪肝病研究现状

1．3 蛋白质组学技术在脂肪肝病上的应用

1．4 研究目的与意义

第二章 实验材料与方法

2．1 脂肪肝病罗非鱼模型的建立

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．1．3 模型评分标准

2．2 脂肪肝差异蛋白iTRAQ分析

2．2．1 肝脏蛋白提取

2．2．2 蛋白质定量

2．2．3 蛋白酶切及iTRAQ试剂标记

2．2．4 第一维高pH-RP液相分离

2．2．5 第二维反相液质联用RPLC-MS

2．2．6 数据检索

第三章 实验结果

3．1 肝体比、肝脏脂肪含量、肝脏生理指标

3．2 肝脏组织学观察

3．3 iTRAQ脂肪肝差异蛋白质组学结果

3．3．1 BCA Protein Assay Kit BSA蛋白浓度标准曲线

3．3．2 鉴定质量评估

3．3．3 肽段长度分布图

3．3．4 蛋白质鉴定结果与差异蛋白的筛选

3．3．5 差异表达蛋白的GO分析

3．3．6 差异蛋白的KEGG Pathway分析

3．3．8 目的蛋白的挑选

第四章 讨论

4．1 动物脂肪肝模型的建立

4．1．1 选择建立脂肪肝模型的方法

4．1．2 脂肪肝模型的评分标准

4．2 炎症反应相关差异蛋白与脂肪肝的关系

4．3 胰岛素抵抗相关差异蛋白与脂肪肝的关系

4．4 丛生蛋白与SPARC蛋白与脂肪肝的关系

4．5 脂肪、胆固醇合成相关差异蛋白与脂肪肝形成的关系

4．6 参与脂肪分解途径与NAFLD形成通路的差异蛋白与脂肪肝形成的关系

4．7 参与脂肪转运途径的差异蛋白与脂肪肝形成的关系

第五章 结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文