红麻UG93细胞质雄性不育相关基因的筛选、克隆及表达分析

摘要

植物细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility，CMS)普遍存在于植物界，植物CMS不育机理的阐明对于人工创制新的细胞质雄性不育资源、调控CMS的育性具有重要意义。前人对植物CMS机理的研究，大多数是以胞质差异较大的不育系和保持系为材料，比较二者线粒体基因组的差异，由此挖掘与植物CMS密切相关的基因。由于细胞质雄性不育系和保持系胞质来源不同细胞质基因组遗传信息差别很大，容易造成CMS以外的累赘遗传信息的干扰。因此本研究以红麻细胞质近等基因系UG93A、UG93B及F1(UG93A/福红992)为研究材料，对红麻线粒体基因nad3、nad9、nad4L、nad6、nad9、sdh4、cob、atp1、atp4等15个基因进行了克隆和表达分析，以此挖掘与红麻CMS密切相关的基因，获得的结果如下:
　　1.获得不育系UG93A、保持系UG93B和F1代15个基因编码区，这些基因在UG93A、UG93B和F1中编码区序列差异仅为单碱基突变。利用荧光定量PCR方法研究CMS相关基因在花药发育双核期的表达量，结果表明不育系中CMS相关基因的表达量总体上要低于保持系。
　　2.通过比较分析红麻线粒体基因RNA编辑与CMS的关系，结果表明15个基因在不育系和保持系中RNA编辑差别不大，推测这些基因的RNA编辑可能与红麻UG93细胞质雄性不育无关。
　　3.红麻CMS系和保持系atp4基因的克隆和序列对比发现，细胞质雄性不育系UG93A中atp4基因起始密码子上游5'端存在4bp碱基缺失，1bp碱基插入和4个核苷酸序列差异，Northern Blot技术分析表明其转录本条带并无差异，但在不育系、保持系和F1代双核期花药中表达量存在显著差异，不育系UG93A atp4的表达量是保持系的0.31倍，F1代是保持系的1.32倍，且双核期不育系UG93A复合体V的活性是保持系的0.90倍，推测atp4基因可能与红麻细胞质雄性不育相关，atp4基因在红麻花粉发育能量代谢过程中有着重要的作用。
　　4.红麻不育系、保持系和恢复系花药不同发育时期线粒体复合体V活性和ATP含量测定结果显示，在花药发育的单核期和双核期线粒体复合体V的活性均表现出不育系低于保持系和恢复系，呈递增趋势，而且单核期复合体V活性低于双核期。红麻不育系、保持系和恢复系在花药发育的单核期ATP含量没有显著差异，而双核期呈现出递增趋势，结果表明花药发育的双核期能量供给不足可能与雄性不育密切相关。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 植物细胞质雄性不育概述

1．2 线粒体基因组与CMS的关系

1．2．1 线粒体基因组结构

1．2．2 线粒体基因重排与CMS

1．2．3 线粒体基因RNA编辑和CMS关系

1．3 线粒体能量代谢与CMS

1．4 植物CMS机理研究进展

1．5 红麻细胞质雄性不育机理研究进展

1．6 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 材料

2．1．2 实验仪器

2．1．3 实验试剂

2．2 实验方法

2．2．1 红麻DNA的提取

2．2．2 红麻RNA的提取及反转录

2．2．3 DNA和cDNA的PCR扩增、回收

2．2．4 目的片段克隆、测序

2．2．5 线粒体基因RNA编辑频率分析

2．2．6 线粒体基因相对表达量

2．2．7 Northem Blot分析

2．2．8 红麻ATP含量测定

2．2．9 红麻线粒体复合体V活性测定

3 结果与分析

3．1 DNA、RNA以及cDNA的检测

3．1．1 DNA、RNA样品的质量

3．1．2 cDNA样品的质量

3．2 红麻UG93细胞质雄性不育相关候选基因的克隆

3．2．1 复合体Ⅰ NADH脱氢酶基因(nad3．nad4L．nad6．had9)克隆分析

3．2．2 复合体Ⅱ基因(sdh4)克隆分析

3．2．3 复合体Ⅲ基因(cob)克隆分析

3．2．4 复合体Ⅴ基因(atp1．atp4)克隆分析

3．2．5 核糖体蛋白基因(rps12．rps14．rpl5．rpl1O)克隆分析

3．2．6 细胞色素C生物起源相关的基因(ccmb．ccmc)及matR的克隆分析

3．3 不育系UG93A及其保持系UG93B RNA编辑比较

3．3．1 nad9基因的RNA编辑分析

3．3．2 cob基因的RNA编辑分析

3．3．3 atp1基因的RNA编辑分析

3．3．4 atp4基因的RNA编辑分析

3．3．5 rpl5基因的RNA编辑分析

3．3．6 rpl10基因的RNA编辑分析

3．3．7 matR基因的RNA编辑分析

3．4 不育系UG93A及其保持系UG93B序列差异基因荧光定量分析

3．4．1 nad9基因荧光定量分析

3．4．2 sdh4基因荧光定量分析

3．4．3 cob基因荧光定量分析

3．4．4 atp1基因荧光定量分析

3．4．5 atp4基因荧光定量分析

3．4．6 rps14基因荧光定量分析

3．4．7 rpl5基因荧光定量分析

3．4．8 rpl10基因荧光定量分析

3．4．9 matR基因荧光定量分析

3．5 atp4基因Northern Blot分析

3．6 复合体Ⅴ(ATP合成酶)活性测定

3．7 红麻花药ATP含量测定

4 结论与讨论

4．1 讨论

4．1．1 红麻线粒体基因CDS区与CMS关系

4．1．2 红麻RNA编辑特点与CMS关系

4．1．3 不同胞质中红麻线粒体基因的差异表达

4．1．4 线粒体能量代谢基因atp4与红麻CMS的关系

4．1．5 线粒体能量代谢与红麻CMS的关系

4．2 结论

4．3 创新点

4．4 问题与展望

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表论文情况