转Ea-DREB2B基因甘蔗苗期抗旱性及相关基因表达分析

摘要

与传统育种相比，分子育种可以大大缩短育种周期，并且获得甘蔗生长上所需的优良性状。农业部甘蔗生理生态与遗传改良实验室利用拟南芥中克隆获得的诱导型启动子rd29A，构建高效植物表达载体，将从斑茅克隆的抗旱调控基因Ea-DREB2B，通过基因枪转化的方法获得一批转Ea-DREB2B基因的甘蔗无性系材料。本研究通过抗旱评价，选用抗旱能力相对较强的转基因甘蔗T7和T11作为研究材料，以受体材料FN95-1702和栽培面积较大的ROC22为对照，通过桶栽模拟自然干旱条件，研究水分胁迫下转基因甘蔗T7和T11及对照的致死天数、生理响应及相关基因表达量变化等。探讨转基因甘蔗在水分胁迫下的抗旱特性及抗旱机理。主要结果如下:
　　1、在水分胁迫下，转基因甘蔗T7和T11在持续干旱胁迫甘蔗致死天数、光合作用、渗透调节、膜破坏程度和保护酶活性等几个方面表现比对照要好，表明了干旱条件下转Ea-DREB2B基因甘蔗T7和T11有较强的适应性。
　　(1)通过PCR对T7和T11叶片中的Ea-DREB2B基因进行检测，在转基因T7和T11材料中能检测到EaDREB2B基因，在受体材料FN95-1702中未能发现目的基因，表明EaDREB2B基因能在甘蔗中稳定遗传。
　　(2)在干旱胁迫下，转基因甘蔗T7和T11叶片中的Ea-DREB2B基因在叶片内高效表达，并呈现“升高-升高-降低”的表达变化特点，复水10天后，表达量仍在正常供水处理的2倍左右。在干旱胁迫下，T7和T11叶片中叶绿素a、b及叶绿素总量保持较高的含量;在持续的干旱胁迫下，T7和T11甘蔗致死水分临界点及所有植株完全致死所需的天数均高于ROC22和FN95-1702，表明转Ea-DREB2B基因的甘蔗有较强的耐旱性。
　　(3)干旱胁迫下，转Ea-DREB2B基因甘蔗T7和T11叶片中的可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量大量积累，积累量要高于受体材料FN95-1702和对照ROC22;通过叶片中渗透物质的调节，T7和T11叶片相对含水量降幅低于FN95-1702和ROC22;复水处理后，叶片中脯氨酸和可溶性糖含量急剧下降;可溶性蛋白下降较慢;叶片相对含水量上升。
　　(4)在干旱胁迫下，T7和T11叶片的质膜透性低于FN95-1702和ROC22，重度胁迫时，T7和T11叶片丙二醛的含量低于FN95-1702，表明干旱胁迫下转基因甘蔗的膜脂过氧化损坏程度较低。同时T7和T11叶片中保护酶(SOD、POD)的活性高于对照，积极地清除细胞内活性氧，大大减少了膜脂氧化程度和对膜的伤害。
　　2、干旱胁迫下，T7和T11叶片Ea-DREB2B基因过表达作用。相比正常供水，T7和T11叶片保护酶相关基因(CAT、Fe/Mn-SOD、APX)的相对表达量要明显高于ROC22和FN95-1702，可以看出转基因甘蔗积极的清除细胞内的活性氧。复水后，CAT基因表达量仍然较高。渗透调节物质相关酶基因(PRODH、SRM)在干旱胁迫下表现为下调表达，其中PRODH基因表达量要低于FN95-1702，复水后PRODH基因表达量迅速上升;而SRM基因整体表达趋势为“下降-上升-上升”。PP2C基因与ABF基因表达情况与Ea-DREB2B基因表达趋势比较一致，在干旱胁迫下，PP2C基因和ARF基因均为上调表达，转基因甘蔗的相对表达量明显要高于FN95-1702。转Ea-DREB2B基因甘蔗通过调控能有效的提高甘蔗的抗旱能力。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 概述

1．2 干旱胁迫对植物生理响应和相关基因表达

1．2．1 干旱胁迫对植物渗透调节物质变化的影响

1．2．2 干旱胁迫对植物活性氧变化的影响

1．2．3 干旱胁迫对植物光合作用的影响

1．2．4 干旱胁迫下植物抗旱相关基因的表达

1．3 DREB类转录因子在干旱胁迫中的作用

1．4 本研究的目的及意义

1．5 技术路线

2 材料与方法

2．1 供试材料

2．2 材料种植

2．3 材料处理

2．4 采样

2．5 实验测定的生理指标和方法

2．5．1 土壤相对含水量测定

2．5．2 叶片相对含水量的测定方法

2．5．3 叶绿素含量的测定

2．5．4 质膜透性的测定

2．5．5 脯氨酸含量的测定

2．5．6 丙二醛含量的测定

2．5．7 可溶性糖含量的测定

2．5．8 可溶性蛋白含量的测定

2．5．9 过氧化物酶活性的测定

2．5．10 超氧化物歧化酶活性的测定

2．6 转基因甘蔗的PCR检测

2．6．1 甘蔗叶片基因组DNA提取

2．6．2 转基因甘蔗Ea-DREB2B基因的PCR检测

2．7 甘蔗叶片总RNA的提取与检测

2．8 甘蔗叶片cDNA的合成

2．9 Real-time RT-PCR分析

2．10 引物设计

2．11 数据统计分析

3 结果与分析

3．1 转Ea-DREB2B基因甘蔗遗传稳定性及抗旱性分析

3．1．1 转Ea-DREB2B基因甘蔗遗传稳定性分析

3．1．2 干旱胁迫对土壤相对含水量及甘蔗致死天数的影响

3．2 干旱胁迫下甘蔗的生理生化基础

3．2．1 干旱胁迫对甘蔗叶片叶绿素含量的影响

3．2．2 干旱胁迫对甘蔗叶片相对含水量的影响

3．2．3 干旱胁迫对甘蔗叶片可溶性糖含量的影响

3．2．4 干旱胁迫对甘蔗叶片可溶性蛋白含量的影响

3．2．5 干旱胁迫对甘蔗叶片脯氨酸含量的影响

3．2．6 干旱胁迫对甘蔗叶片细胞膜相对透性的影响

3．2．7 干旱胁迫对甘蔗叶片丙二醛含量的影响

3．2．8 干旱胁迫对甘蔗叶片POD活性的影响

3．2．9 干旱胁迫对甘蔗叶片SOD活性的影响

3．2．10 中度胁迫下甘蔗生理生化差异及相关性分析

3．2．11 重度胁迫下甘蔗生理生化差异及相关性分析

3．2．12 小结

3．3 水分胁迫下甘蔗抗旱相关基因表达量分析

3．3．1 干旱胁迫对甘蔗叶片Ea-DREB2B基因表达的影响

3．3．2 干旱胁迫对甘蔗叶片PP2C基因表达的影响

3．3．3 干旱胁迫对甘蔗叶片CAT基因表达的影响

3．3．4 干旱胁迫对甘蔗叶片Fe／Mn-SOD基因表达的影响

3．3．5 干旱胁迫对甘蔗叶片ABF基因表达的影响

3．3．6 干旱胁迫对甘蔗叶片PRODH基因表达的影响

3．3．7 干旱胁迫对甘蔗叶片SRM基因表达的影响

3．3．8 干旱胁迫对甘蔗叶片APX基因表达的影响

3．3．9 小结

4 讨论与结论

4．1 讨论

4．1．1 水分胁迫下甘蔗的生理响应机制

4．1．2 水分胁迫下甘蔗叶片抗旱相关基因的差异表达

4．2 结论

4．3 问题与展望

致谢

参考文献

作者在攻读硕士学位期间科研和论文发表等情况