猪繁殖与呼吸综合征TJ株疫苗免疫与野毒株感染鉴别诊断的研究

摘要

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)，是引起妊娠母猪繁殖失败，仔猪乃至各年龄段的猪呼吸障碍的病毒性传染病，俗名“猪蓝耳病”。PRRS死亡率高、传播迅速、产生免疫抑制，PRRS的暴发给许多国家养猪业造成了极大的损失。猪繁殖与呼吸综合征病毒不同毒株在致病力、抗原性和生物学特性上存在一定差异，毒株的变异、重组时有发生，所以导致了单一PRRSV疫苗不能完全保护猪免受异源毒株的感染，使得该病的疫苗大量、多种的滥用，虽然能减轻临床症状，但不能阻止强毒的感染和持续性感染的发生，难以从根本上消除PRRS的威胁，所以PRRS的净化正在成为许多猪场的选择。由于传统的血清学检测在野毒株和疫苗株的检测上缺乏稳定准确的方法，所以迫切需要建立鉴别区分PRRSV野毒感染抗体与疫苗免疫抗体的检测方法。
　　本研究通过比对PRRSV毒株序列发现PRRSV TJ株Nsp2基因中缺失307个碱基，设计特异性引物。试验提取包含完整Nsp2基因的PRRSV JX株病毒抗原RNA，通过RT-PCR扩增PRRSV-Nsp2-N1N2基因（缺失片段基因），并构建表达质粒pET-32a-N1N2。通过E.coli BL21大肠杆菌原核表达系统诱导表达融合蛋白，SDS-PAGE验证融合蛋白为可溶性表达，存在于处理菌液的上清中。融合蛋白经His-tag亲和层析柱纯化，得到了纯度和特异性都较高的融合蛋白。
　　用纯化的融合蛋白pET-32a-N1N2作为固相包被抗原，建立间接酶联免疫吸附试验方法，对反应的各项条件进行选择优化，确定阴阳性判断的临界值。最佳抗原包被浓度为75ng/孔，待检猪血清稀释度为1∶200，酶标抗体工作浓度为1∶5000，封闭液、待检血清和TMB显色时间分别为60min、60min、20min;阴阳性判断:P＞0.4401，且P/N＞2.5判为阳性。符合性试验中选取138份阳性血清和50份阴性血清与PRRSV商品化间接ELISA检测试剂盒比对，符合率为100％。通过本试验表明，建立的ELISA检测方法敏感性、重复性和特异性都较高，可区分蓝耳病的TJ株疫苗抗体和野毒感染抗体，为种猪场蓝耳病的净化提供了技术保障。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

第一章 前言

1．1 猪繁殖与呼吸综合征概况

1．2 PRRS病原学

1．3 PRRS流行病学

1．4 PRRS免疫学

1．5 临床症状和病理变化

1．6 PRRS疫苗

1．7 PRRSV检测方法

1．8 PRRS的净化

1．9 本研究的目的和意义

第二章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 病毒、菌株和载体

2．1．2 血清

2．1．3 试剂

2．1．4 主要溶液配制

2．1．5 主要耗材

2．1．6 主要设备

2．2 实验方法

2．2．1 PPRSV-Nsp2-N1N2基因的克隆

2．2．2 pET-32a-N1N2原核表达载体构建

2．2．3 PRRSV-Nsp2-N1N2基因蛋白的诱导表达

2．2．4 PPRSV-Nsp2-N1N2基因蛋白间接ELISA的建立

2．2．5 PPRSV-Nsp2-N1N2基因蛋白间接ELISA方法的鉴定

第三章 结果

3．1 PRRSV-Nsp2-N1N2基因的克隆与分析

3．1．1 N1N2基因PCR扩增结果

3．1．2 重组质粒pMD18-T-N1N2的构建

3．2 重组质粒pET-32a-N1N2的构建

3．3 融合蛋白pET-2a-N1N2的原核表达

3．3．1 重组菌表达结果

3．3．2 重组菌最佳诱导时间的优化

3．3．3 重组菌最佳诱导浓度的优化

3．3．4 重组蛋白的可溶性分析

3．3．6 纯化pET-32a-N1N2融合蛋白的Western blot检测

3．4 间接ELISA方法建立

3．4．1 间接ELISA最适反应条件的确定

3．4．2 间接ELISA阴阳临界值的确定

3．4．3 特异性检验

3．4．4 敏感性评价

3．4．5 符合性检验结果

3．4．6 批内和批间重复性试验结果

3．4．7 板内和板间重复性试验结果

第四章 讨论

4．1 PRRSV疫苗毒株和野毒株鉴别

4．2 原核表达系统

4．3 间接ELISA方法的建立

4．3．2 间接ELISA方法的优化

4．3．3 间接ELISA方法的初步应用

第五章 结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间论文发表情况