BAG3抑制埃博拉病毒和马尔堡病毒VLP出芽及其机制探索

摘要

埃博拉病毒属(ebolavirus，EBOV)与马尔堡病毒属(marburgvirus，MARY)同属于丝状病毒科filoviridae），能够导致人类与灵长类动物的严重病毒性出血热，是感染死亡率极高的人兽共患病病原。目前尚没有公认的疫苗或药物能够确实地预防和治疗EBOV和MARV的感染。2014-2016年中非、西非国家暴发的严重埃博拉疫情及一些欧美国家的零星散发病例使得这一致命病原再次受到广泛关注。丝状病毒对全球公共卫生安全的威胁不断，深入探索该病毒生物学特性与致病机理的重要性尤为凸显。
　　病毒侵入细胞进行复制循环后，子代病毒需要从宿主细胞释放，进而感染其他细胞而进行传播。丝状病毒的出芽释放是病毒生命周期的重要阶段，也是其传播、致病的必要环节。本研究旨在了解与阐明哪些宿主蛋白、哪些细胞进程（正/负）调控了丝状病毒EBOV、MARV病毒粒子的出芽释放过程。
　　丝状病毒基质蛋白VP40是负责病毒粒子装配与出芽的关键成分，在哺乳动物细胞中，该蛋白能够独立地装配成形态上与感染性病毒粒子相似的病毒样颗粒(Virus like particle，VLP)，并模拟活病毒出芽的方式从细胞中释放。丝状病毒EBOV与MARV的VP40蛋白介导的自我装配为VLP并出芽释放的这一特性，为深入了解病毒出芽机制提供了可靠的研究手段。
　　VP40蛋白的晚期出芽结构域(Late budding domain，L-domain)是介导VLP与病毒粒子出芽的关键功能区域。PPxY、P(T/S)AP、YPx(n)L等由4个（及以上）氨基酸残基构成的“基序”(motif)为L-domain的重要功能元件。L-domain基序能够与不同的宿主蛋白结合，“挟持”这些蛋白与相关的宿主细胞机制来共同完成病毒的出芽释放。EBOV和MARV的VP40蛋白均携带L-domain基序PPxY，该基序为WW domain的典型配体之一，而WW domain是广泛存在于宿主蛋白上的、介导蛋白间相互作用的功能模块。因此，VP40蛋白能够通过PPxY基序与携带WW domain的宿主蛋白结合。例如，VP40PPxY基序通过结合HECT E3泛素连接酶Nedd4和ITCH蛋白的WW domain而对它们进行招募，介导自身的泛素化并促进病毒粒子和VLP的出芽。
　　为了鉴定出更多的、能够与VP40PPxY基序结合的、含WW domain的宿主蛋白，本研究首先构建了由115个蛋白WW domain组成的PPxY“脯氨酸富集”基序阅读阵列，利用含EBOV VP40L-domain基序的肽段“扫描”该阵列，成功鉴定出多个能够与PPxY基序发生特异性反应的宿主蛋白WW domain，如Bcl-2相关永生基因3(Bcl-2associated athanogene3，BAG3)蛋白。本研究利用GST-Pulldown与免疫共沉淀等方法验证了BAG3蛋白与EBOV、MARVVP40蛋白在体外及细胞内的相互结合，并通过突变体实验证实该相互作用依赖于BAG3的WW domain与VP40的PPxY基序之间的相互作用机制。
　　EBOV VP40L-domain基序在“PPxY”阅读阵列中只能结合部分宿主蛋白WW domain，说明PPxY—WW domain的相互作用同时具备特异性与选择性。由于VP40蛋白的关键功能是介导病毒粒子出芽，本研究为评估BAG3-VP40间高度选择性和特异性的相互作用可能具有的特定生物学意义，利用了VLP出芽实验测定BAG3对VP40出芽过程的影响。结果发现，BAG3蛋白能够以剂量依赖性的方式抑制VP40所介导的VLP出芽，降低细胞内源性的BAG3蛋白表达能够增加VLP的产量。BAG3与之前鉴定的全部含WW domain宿主蛋白不同，它并非被VP40“挟持”来促进病毒的出芽，而是表现出抑制病毒出芽的能力。BAB3的抑制出芽功能也需要依赖PPxY—WW domain之间的相互作用。实验还证实，BAG3能够阻碍携带EBOV VP40L-domain基序的感染性重组病毒VSV-M40从细胞中释放，说明BAG3对出芽的负调控不仅作用于VLP的出芽，也能够抑制感染性病毒粒子的出芽释放。
　　BAG3是共-分子伴侣蛋白BAG家族的成员，能够调节多种关键的细胞生理进程。作为一种细胞压力应激诱导的促细胞存活蛋白，BAG3具有抗细胞凋亡与促细胞自噬的活性，参与分子伴侣相关的选择性自噬(selective autophagy)进程，能够将错误折叠蛋白或外源蛋白扣押入细胞聚集体(aggresome)中，利于下游自噬—溶酶体系统对这些靶标蛋白进行降解，协助维持细胞内蛋白稳态。
　　为了探明BAG3通过何种机制抑制VP40介导的VLP出芽，本研究通过活细胞共聚焦显微镜成像实验，发现BAG3能够显著改变VP40在细胞内的定位，导致VP40不能聚集到细胞外缘区域，无法形成胞膜突触。利用细胞组分分离技术与双染色间接免疫荧光实验，证实BAG3能够将VP40滞留在细胞浆内，阻止VP40定位到细胞膜上的出芽位点，从而抑制VP40所介导的VLP装配与出芽。最关键的是，BAG3能够导致一部分的VP40蛋白扣押在细胞核周边区域的聚集体中，该聚集体携带细胞自噬体的标志蛋白LC3-Ⅱ，表明BAG3的促细胞自噬和分子伴侣相关选择性自噬活性参与了对VLP出芽的抑制机制。实验还证实，BAG3可以竞争性地阻碍VP40与其他促病毒出芽的WW domain宿主蛋白(如Nedd4、ITCH)的结合，这一特性也可能参与了BAG3对VLP出芽的负调控机制。
　　综上所述，本研究成功鉴定出BAG3蛋白为丝状病毒EBOV与MARVVP40的互作宿主蛋白，能够抑制VP40VLP的出芽和感染性重组病毒的释放。作为首个被发现能够与VP40互作并负调控病毒出芽过程的WW domain宿主蛋白，BAG3的表达显著改变VP40的细胞内定位，利用自身的细胞自噬相关活性将部分VP40扣押在细胞聚集体中，阻止VP40定位到细胞膜上的出芽位点，并竞争性阻碍VP40与促病毒出芽的WW domain宿主蛋白结合，阻断VP40介导的VLP出芽过程。这些结果显示，BAG3可能代表了一种新的、特异的宿主防御策略，抑制丝状病毒VP40蛋白的功能，阻断病毒出芽及病毒传播扩散。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

第一章 文献综述

1．1．丝状病毒研究概述

1．1．1．丝状病毒流行病学

1．1．2．丝状病毒感染的临床症状

1．1．3．丝状病毒的种属分类

1．1．4．丝状病毒的形态、基因组结构与病毒蛋白

1．2．丝状病毒基质蛋白VP40与病毒出芽

1．2．1．VP40蛋白的构象与功能

1．2．2．VP40介导病毒出芽的工作模式

1．2．3．VP40蛋白的功能区域

1．2．4．Late budding domain

1．2．5．与VP40相互作用的促出芽宿主蛋白

1．3．ESCRT机制与病毒出芽

1．3．1．ESCRT机制概述

1．3．2．ESCRT与病毒出芽

1．4．影响病毒出芽的其他病毒结构蛋白

1．5．影响病毒出芽的其他宿主因素

1．5．1．细胞骨架成分—肌动蛋白

1．5．2．细胞质膜的磷脂丝氨酸水平

1．5．3．钙离子通道

1．6．1．WW domain概述

1．6．2．PPxY—WW domain相互作用与病毒出芽

1．7．丝状病毒出芽的抑制因素

1．7．1．抑制丝状病毒出芽的宿主蛋白

1．7．2．阻断丝状病毒出芽的小分子抑制剂

1．8．BAG3蛋白研究概述

1．8．1．BAG3蛋白的结构与功能

1．8．2．BAG3蛋白与病毒生命周期的联系

1．9．细胞自噬与病毒生命周期

1．10．研究目的与意义

第二章 BAG3与EBOV和MARV VP40相互作用及对VP40介导的病毒出芽的影响

2．1．材料

2．1．1．细胞

2．1．2．病毒

2．1．3．质粒

2．1．4．抗体

2．1．5．主要试剂

2．2．方法

2．2．1．脯氨酸富集(Proline rich)基序PPxY阅读阵列的构建与“扫描”

2．2．2．质粒的细菌转化

2．2．3．蛋白的原核表达

2．2．4．菌体蛋白的提取

2．2．5．真核表达质粒的细胞转染

2．2．6．SDS-PAGE与Western blot

2．2．7．GST-pulldown

2．2．8．免疫共沉淀

2．2．9．病毒样颗粒VLP的收获与检测

2．2．10．siRNA的转染

2．2．11．压制细胞内BAG3表达对VLP出芽的影响

2．2．12．VSV-M40重组病毒的感染

2．2．13．病毒滴度的测定

2．3．结果

2．3．2．BAG3 WW domain结合eVP40 PPxY基序

2．3．3．BAG3 WW domain在体外通过PPxY基序结合eVP40与mVP40

2．3．4．BAG3在细胞内结合eVP40和mVP40

2．3．5．WW domain是BAG3—VP40蛋白相互作用的必要条件

2．3．6．BAG3—VP40相互作用抑制VP40介导的病毒样颗粒出芽

2．3．7．BAG3通过剂量依赖的方式抑制VP40介导的VLP出芽

2．3．8．压制细胞内源性BAG3的表达促进VP40 VLP的出芽释放

2．3．9．BAG3抑制感染性重组病毒VSV-M40的释放

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 BAG3调控VP40介导出芽过程的机制探索

3．1．材料

3．1．1．细胞

3．1．2．病毒

3．1．3．质粒

3．1．4．抗体

3．1．5．主要试剂

3．2．方法

3．2．1．活细胞成像

3．2．2．细胞质与细胞膜蛋白组分的分离提取

3．2．3．双染色间接免疫荧光实验

3．2．4．BAG3竞争性抑制VP40-Nedd4／ITCH结合实验

3．2．5．VSV-eGP重组病毒的感染

3．3．结果

3．3．1．BAG3改变eVP40的细胞内分布定位

3．3．2．BAG3减少细胞膜上eVP40和mVP40蛋白的含量

3．3．3．BAG3阻碍eVP40蛋白向细胞膜聚集

3．3．4．BAG3导致eVP40蛋白被扣押入细胞内的聚集体中

3．3．5．BAG3竞争性阻碍eVP40与其他促出芽“WW”宿主蛋白的结合

3．3．6．重组病毒VSV-eGP诱导细胞内BAG3表达上调

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 结论

参考文献

附表

致谢

攻读学位期间发表论文情况