手工克隆生产转植酸酶基因猪的研究

摘要

随着畜牧业快速迅猛的发展，畜禽养殖业的粪污已成为我国环境污染的主要来源之一。猪鸡等单胃动物不能分泌植酸酶，使大量的磷从动物的粪中排出体外，对环境造成了很大的影响。所以，提高饲料中植酸磷的利用率，对保护环境和磷资源的节约利用有非常重大的意义。植酸酶是一种水解酶，可以将植酸分解成肌醇和磷酸而被动物消化吸收。因此，可通过植酸酶的作用增加日粮中植酸磷的利用率来减少粪中磷的排放，从而减轻磷对环境的污染。随着基因工程技术的快速发展，尤其是转基因动物生产技术水平的逐渐提高，为这些问题的解决提供了一条新途径。通过猪和禽等单胃动物自身消化道产生具有较高生物活性的内源性植酸酶，已经成为解决单胃动物高磷粪便污染的一种研究策略和手段。
　　本课题成功地将编码对胃蛋白酶和胰蛋白酶具有稳定性，对底物有较高亲和力的植酸酶的基因与猪腮腺特异性表达的分泌蛋白调控序列（PSP启动子）进行整合，构建猪腮腺特异性表达的转基因载体p-PSP-Intron-Cafp和PSP-Cafp-IRES-EGFP。PSP-Cafp-IRES-EGFP转基因载体在小鼠腮腺细胞中成功组织特异性表达。
　　本课题建立并优化了胚胎成熟培养体系。在成熟培养体系中，发现培养22-24h时，卵母细胞的成熟液不添加FBS的成熟效果优于添加FBS的成熟效果。在培养体系中，pzm-3培养液比NCSU培养液更适于胚胎培养。当使用NCSU培养液时，在培养的第4天添加10％FBS可以显著提升囊胚率。在孤雌激活试验中，激活参数为120V，30μs，3脉冲的效果最好。
　　本研究通过电转染细胞的方法，将p-PSP-Intron-Cafp载体转染大白猪(DB)和长白猪(LW)的成纤维细胞，成功获得了转植酸酶Cafp基因的DB和LW两组转基因阳性细胞系。以这些阳性细胞系为手工克隆的供体细胞，通过手工克隆技术在体外生产了转基因囊胚810枚，将其中质量较好的712枚囊胚移植到6头受体母猪体内，成功受孕4头。3头受孕猪成功分娩活仔猪14头，断奶存活仔猪6头。PCR结果显示，4头断奶前死亡的仔猪和3头存活的仔猪携带植酸酶Cafp基因。FISH实验发现断奶的6头仔猪有5头为转基因阳性个体。PAGE实验结果显示，断奶成活的6头转基因猪唾液均有阳性蛋白带，但质谱测定却没有检测到植酸酶基因Cafp的表达。实验猪6月龄时进行磷的表观消化率测定，结果显示对照组磷的表观消化率平均为47.2％，转植酸酶基因阴性猪组平均为44.7％，转植酸酶基因阳性猪组平均为57.17％。转植酸酶基因阳性猪磷的排放量平均比对照组降低了10百分点，差异显著(P＜0.05)。对大于6月龄后死亡的3头转基因猪进行免疫组化检测，结果发现1头转基因阳性猪的腮腺组织表达了植酸酶基因Cafp，其他组织中均没有表达，另外2头转基因阴性猪的腮腺组织和其他组织中均没有表达，表明植酸酶基因Cafp能在转基因阳性猪腮腺组织中特异性表达。
　　综上所述，本课题成功地生产出转植酸酶基因猪，为后续培育更多的环保转基因猪提供了育种的理论依据与实践方法。

目录

声明

论文说明

摘要

文中缩略词中英文对照

1 我国养猪业的概况

2 养猪业引起的环境污染问题

3 转基因动物研究进展

3．1 显微注射转基因动物

3．2 精子载体法转基因动物

3．3 病毒载体法转基因动物

3．4 体细胞核移植的研究进展

4 手工克隆的研究进展

5 环保转基因猪研究

5．1 植酸和植酸酶

5．2 唾液腺生物反应器

6 本研究的目的和意义

第二章 转植酸酶基因真核表达载体的构建及鉴定

1 实验材料

1．1 菌种和质粒

1．2 药品和试剂盒

1．3 主要仪器设备

1．4 主要试剂的配制

2 实验方法

2．1 载体构建的技术路线

2．2 实验方法

3 结果与分析

3．1 p-PSP-Intron-Cafp转基因载体的构建

3．2 PSP-Cafp-IRES-EGFP转基因载体的构建

4 讨论

5 本章小结

第三章 PSP启动子的功能验证及转基因阳性细胞筛选与鉴定

1 实验材料

1．1 实验样品

1．2 实验试剂

1．3 实验仪器

1．4 主要耗材

1．5 配制的溶液和培养基

2 实验方法

2．1 细胞复苏

2．2 细胞传代

2．3 细胞换液

2．4 细胞冻存

2．5 细胞电转及参数

2．6 细胞挑克隆

2．7 细胞DNA的提取

2．8 细胞PCR鉴定

2．9 LTX试剂转染细胞方法

2．10 细胞RNA的提取

2．11 细胞RT-PCR检测

3 结果与分析

3．1 PSP启动子在腮腺细胞上的表达验证

3．2 转p-PSP-Intron-Cafp质粒成纤维细胞的筛选与鉴定

4 讨论

5 本章小结

第四章 胚胎成熟培养体系的优化及手工克隆生产转基因猪

1 实验材料

1．1 实验样品

1．2 实验试剂

1．3 实验仪器

1．4 主要耗材

1．5 配制的溶液和培养基

2 实验方法

2．1 猪卵巢的采集

2．2 卵母细胞的采集

2．3 卵母细胞的体外成熟

2．4 孤雌激活

2．5 手工克隆

2．6 囊胚细胞计数

2．7 数据统计分析

2．8 胚胎移植

3 结果与分析

3．1 猪胚胎成熟培养体系的优化

3．2 转基因猪的制备

4 讨论

5 本章小结

第五章 转基因猪的阳性鉴定

1 实验材料

1．1 实验样品

1．2 实验试剂

1．3 实验仪器

1．4 配制的溶液和培养基

2 实验方法

2．1 组织DNA提取

2．2 PCR鉴定

2．3 荧光原位杂交检测

2．4 唾液蛋白PAGE检测

2．5 磷消化率的测定

2．6 HE染色及免疫组化实验步骤

3 结果与分析

3．1 转基因猪PCR鉴定

3．2 FISH的结果

3．3 PAGE电泳结果

3．4 磷的表观消化实验

3．5 免疫组化实验结果

4 讨论

5 本章小结

全文总结

参考文献

附录

致谢

攻读博士学位期间发表的论文