十字花科黑腐病菌N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶影响细胞分裂和致病性的研究

摘要

革兰氏阴性致病细菌进化了一系列不同的分泌系统，如跨越细胞内膜和外膜的Ⅱ型(T2SS)、Ⅲ型(T3SS)和Ⅳ型(T4SS)等分泌系统，这些分泌系统将致病因子转运至宿主细胞引起病害。细菌内外膜之间的周质空间含有严密的肽聚糖(PG)层，它使细胞能承受膨压而维持完整性及特定形状。但是，PG层也成了阻碍分泌系统跨膜组装的屏障。因此，PG层需通过其裂解酶局部重组，为分泌系统的组装提供空间和受体位点。细菌含有三类主要的PG裂解酶，一类是切割肽聚糖骨架中的糖苷键的糖苷酶，第二类是切割肽聚糖侧链的酰胺酶，第三类是切割侧链中的肽链的内切酶。后两类酶对分泌系统的作用还毫无知晓。
　　十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris，Xcc)的野生型菌株8004含有4种切割肽聚糖侧链的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶，根据它们与大肠杆菌酰胺酶在序列上的同源性和结构上的相似性，命名为AmiC1，AmiC2，AmpD和AmiD。本研究对它们在细胞分裂和致病性中的作用进行了研究。构建了amiC1、amiC2、ampD、amiD基因的突变体amiC1∷pK18、ΔamiC2、ΔampD、ΔamiD及amiC1和amiC22个基因的双突变体amiC1∷pK18ΔamiC2。通过显微镜观察发现，amiC1∷pK18和amiC1∷pK18ΔamiC2呈不间断的链状细胞，ΔamiC2大多数细胞与野生型一样，呈短杆状单细胞，小部分呈几个细胞相连的短链状，ΔampD和ΔamiD与野生型一样呈短杆状单细胞。植株试验结果表明，ΔampD、ΔamiD和ΔamiC2的致病力与野生型没有明显差异，ΔamiC2诱导过敏反应(HR)的能力与野生型没有明显差异。而amiC1∷pK18和amiC1∷pK18ΔamiC2的致病力及诱导HR的能力显著低于野生型。这些结果说明AmiC1对十字花科黑腐病菌的细胞分裂及致病性起到重要作用，AmiC2对十字花科黑腐病菌的细胞分裂起一定的作用。
　　本研究通过大肠杆菌表达纯化了带6个组氨酸标签且去掉信号肽区的AmiC1重组蛋白（命名为His6-AmiC1LN32）。酶活分析显示该蛋白与正对照变溶菌素相比，只有微弱的降解PG的活性，这提示AmiC1可能需要别的蛋白激活增强其降解PG的能力。已有研究表明大肠杆菌的AmiA、AmiB、AmiC酰胺酶的活性分别需要LytM家族激活子EnvC（激活AmiA和AmiB）和NlpD（激活AmiC）。十字花科黑腐病菌野生型菌株8004含有10个编码潜在的LytM家族蛋白的基因，其中2个基因分别与大肠杆菌的nlpD和envC具有同源性，因此也命名为nlpD和envC。在显微镜下观察这10个基因的单基因突变体发现，nlpD和envC的突变体ΔnlpD和ΔenvC的细胞形态呈姐妹细胞无法完全分裂的长链状，而其余8个基因的突变体与野生型一样呈短杆状单细胞。这说明NlpD及EnvC在十字花科黑腐病菌的细胞分裂过程中起重要作用。致病力及HR检测发现，只有ΔnlpD突变体的致病力和HR诱导能力严重降低，包括ΔenvC在内的其它所有突变体的致病力及HR诱导能力都与野生型没有明显差异。ΔnlpD、amiC1∷pK18及ΔenvC突变体的细胞分裂都不正常而呈链状，但ΔnlpD和amiC1∷pK18突变体的致病性严重降低，而ΔenvC突变体的致病性没有改变，说明ΔnlpD和amiC1∷pK18突变体致病力降低不完全取决于细胞分裂缺陷。
　　通过大肠杆菌表达纯化了带6个组氨酸标签且去掉信号肽区的NlpD和EnvC重组蛋白（命名为His6-NlpDLN22和His6-EnvCLN14），这两种重组蛋白都不能降解PG，其中His6-NlpDLN22能与PG结合。进一步实验发现，His6-NlpDLN22能显著增强His6-AmiC1LN32对PG的降解能力，而His6-EnvCLN14不能，说明与大肠杆菌相似，十字花科黑腐病菌的AmiC1也需要NlpD激活。
　　本研究对十字花科黑腐病菌细胞中的NlpD蛋白进行了定位。通过同源置换方法把3×Flag标签同框置换到十字花科黑腐病菌野生型菌株8004基因组中nlpD基因的终止密码子之前，构建了重组菌株。分别提取构建的重组菌株细胞各组分蛋白并用Flag抗体为探针进行Western blot检测，结果表明NlpD蛋白在十字花科黑腐病菌细胞中分布在细胞质、周质及外膜上。
　　已有的研究表明T3SS是十字花科黑腐病菌致病及诱导HR必需的，另外，通过T2SS分泌的胞外酶（如蛋白酶、内切葡聚糖酶、淀粉酶等）对十字花科黑腐病菌的致病力也是重要的。本研究已证实AmiC1和NlpD对Xcc致病和诱导HR具有重要的作用，为了解AmiC1和NlpD影响致病和HR诱导的机理，本研究检测了amiC1∷pK18和ΔnlpD突变体的T2SS和T3SS的分泌效率。检测结果显示amiC1∷pK18及ΔnlpD突变体产生的胞外蛋白酶、内切葡聚糖酶及淀粉酶的活性与野生型菌株产生的没有明显差别，但这2个突变体分泌Ⅲ型效应蛋白的效率都严重低于野生型菌株，说明NlpD及AmiC1不影响T2SS，但影响T3SS。十字花科黑腐病菌的T3SS是由hrp基因簇编码的，该基因簇包含6个操纵子(hrpA-hrpF)，这6个操纵子的表达均受一AraC转录激活蛋白家族成员HrpX的直接调控，而编码HrpX的基因hrpX的表达受一双组份调控系统HpaS/HrpG的调控。通过hrpG、hrpX、hrpB的启动子分别与gusA融合的报告子分析发现，amiC1∷pK18和ΔnlpD突变体中的hrpG、hrpX及hrpB的转录水平与野生型菌株中的表达水平没有明显差异，表明AmiC1和NlpD对hrp基因簇的表达没有影响，它们不是通过调控编码T3SS的hrp基因簇的表达而影响T3SS的。
　　另外，本研究还发现nlpD缺失后会导致十字花科黑腐病菌胞外多糖产量和细胞运动性显著降低、细胞聚集性及对pH敏感性增加。
　　综上所述，本研究主要揭示了(1)十字花科黑腐病菌酰胺酶AmiC1降解肽聚糖的活性需要LytM家族调控蛋白NlpD的激活;(2)AmiC1/NlpD对肽聚糖的降解不仅影响十字花科黑腐病菌的细胞分裂，而且还影响致病性;(3)AmiC1/NlpD影响十字花科黑腐病菌的Ⅲ型分泌系统，但不影响Ⅱ分泌系统，这意味着AmiC1/NlpD对肽聚糖侧链的切割很可能是为Ⅲ型分泌系统装置跨膜组装而重建肽聚糖层的重要环节。

目录

声明

摘要

英文缩写说明

1．1 植物病原细菌概述

1．2 黄单胞菌属概述

1．2．1 黄单胞菌属俩介

1．2．2 黄单胞菌属的致病因子

1．2．3 黄单胞菌属致病系统

1．3 细菌分泌系统概述

1．3．1 Ⅰ型分泌系统

1．3．2 Ⅱ型分泌系统

1．3．4 Ⅳ型分泌系统

1．3．6 Ⅵ型分泌系统

1．3．7 Ⅶ型分泌系统

1．3．8 See分泌蛋白转运系统

1．3．9 Tat蛋白转运系统

1．4 细菌细胞壁概述

1．5 细菌肽聚糖裂解酶的概述

1．5．1 裂解性糖基转移酶的概述

1．5．2 肽聚糖内切酶的概述

1．5．3 N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶的概述

1．6 LytM家族的研究进展

1．6．1 NlpD脂蛋白的研究进展

1．6．2 EnvC蛋白的研究进展

1．7 肽聚糖裂解酶影响分泌系统的研究进展

1．8 十字花科黑腐病菌概述

1．9 十字花科黑腐病菌重要致病基因的研究进展

1．10 研究的目的和意义

2．1 菌株

2．2 质粒

2．3 菌株的培养条件和方法

2．4 总DNA的提取

2．5 质粒的提取

2．6 PCR反应

2．7 DNA的纯化

2．8 琼脂糖凝胶电泳

2．9 酶切反应

2．10 连接反应

2．11 电转化感受态的制作

2．12 转化

2．13 阳性克隆的验证

2．13．1 菌裂解PCR验证

2．13．2 酶切验证

2．14 三亲本接合

2．15 点突变构建策略和方法

2．16 致病性的检测

2．17 过敏反应的检测

2．17．1 定性过敏反应的检测

2．17．2 定量过敏反应的检测

2．18 5′RACE确定转录起始位点

2．19 显微镜观察

2．20 胞外酶的检测

2．20．2 胞外蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶的定量检测

2．21 胞外多糖的检测

2．22 运动性的检测

2．23 生物膜的检测

2．24 蛋白的表达

2．25 蛋白的纯化(6×His标签)

2．26 肽聚糖的提取

2．27 肽聚糖与Remazol brilliant blue(RBB)标记

2．28 肽聚糖结合试验

2．29 肽聚糖降解试验

2．30 SDS-PAGE凝胶电泳

2．31 蛋白定量

2．32 Western blotting

2．32．1 试剂耗材的准备

2．32．2 所需溶液

2．32．3 具体操作

2．33 细菌亚细胞定位蛋白的提取

2．33．1 细菌总蛋白懒

2．33．2 细菌外膜蛋白和内膜蛋白的提取

2．33．3 细菌周质蛋白的提取

2．33．4 细菌胞外蛋白的提取

2．34 GUS酶活的测定

第三章 Xcc编码N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶基因突变体及互补菌株的构建

3．1 引言

3．2 生物信息学分析Xcc 8004中的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶基因

3．3 amiD和ampD缺失突变体的构建

3．4 antiC相关突变体和互补菌株的构建

3．5 小结

第四章 Xcc的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶基因对细胞分裂和致病性等的影响分析

4．1 引言

4．3 AmiC1影响Xcc的致病性

4．4 AmiC1影响Xcc在非寄主上的HR

4．5 AmiC1、AmiC2不影响胞外酶但AmiC1影响EPS产量

4．6 AmiC1影响游动性

4．7 小结

第五章 Xcc的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶AmiC1需要潜在激活子的激活

5．1 引言

5．2 AmiC1的E335D点突变互补分析

5．3 带6个组氨酸且去掉信号肽区的AmiC蛋白表达菌株的构建

5．4 体外检测His6-AmiC1LN32具有微弱的降解肽聚糖的活性

5．5 小结

第六章 Xcc LytM家族蛋白NlpD和EnvC对细胞分裂和致病性等的影响分析

6．1 引言

6．2 LytM家族的生物信息学分析

6．3 从突变体库中获得含有LytM结构域基因的突变体

6．4 LytM结构域的突变体中nlpD和envC突变体影响细胞分裂

6．5 LytM结构域的突变体中nlpD突变体显著影响致病

6．6 生物信息学分析Xcc 8004中的EnvC和NlpD

6．6．1 生物信息学分析Xcc 8004中的EnvC

6．6．2 生物信息学分析Xcc 8004中的NlpD

6．6．3 Xcc 8004的nlpD基因转录起始位点的确定以及启动子分析

6．7 Xcc 8004中envC、nlpD缺失突变体和互补菌株的构建

6．7．1 envC缺失突变体和互补菌株的构建

6．7．2 nlpD缺失突变体和互补菌株的构建

6．8 envC和nlpD的突变表型分析

6．8．1 envC和nlpD缺失突变体在NYG和MMX上的生长

6．8．2 envC和nlpD缺失突变体影响细胞分裂

6．8．3 nlpD缺失突变体显著影响致病性

6．8．4 nlpD缺失突变体显著影响HR

6．8．5 envC缺失突变体不影响HR

6．8．6 EnvC和NIpD不影响II型胞外酶，但NlpD影响EPS的合成

6．8．7 envC和nlpD缺失突变体影响游动性

6．8．8 nlpD缺失突变体影响细胞聚集

6．8．9 nlpD缺失突变体对Zn2+敏感

6．8．10 nlpD缺失突变体对pH敏感

6．9 小结

第七章 Xcc通过NlpD激活AmiC1影响细胞分裂和致病性

7．1 引言

7．2 Xcc中NlpD的亚细胞定位

7．2．1 Xcc 8004在基因组上NlpD融合3×Flag标签的菌株构建

7．2．2 Xcc的NlpD分布在细胞质、周质和外膜

7．3 带6个组氨酸标签且去掉信号肽区的NlpD和EnvC蛋白的表达纯化

7．5 His6-NlpDLN22能在体外增强His6-AmiC1LN32降解肽聚糖的活性

7．6 AmiC1及其激活子NlpD影响致病性的机制研究

7．6．2 NlpD／AmiC1影响Ⅲ型效应物XC3176的分泌

7．7 小结

第八章 结论与讨论

8．1 Xcc的AmiC／NlpD／EnvC参与细胞分裂

8．2 Xcc的AmiC1／NlpD参与致病性

8．3 Xcc的AmiC1降解肽聚糖的活性需要LytM家族调控蛋白NlpD的激活

8．4 AmiC1／NlpD影响Xcc的Ⅲ型分泌系统，但不影响Ⅱ分泌系统

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表论文情况