凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)亲虾性腺转录组分析及雌雄性腺差异表达基因鉴定

摘要

凡纳滨对虾是我国乃至世界海水养殖的主导品种，但目前凡纳滨对虾的基础研究薄弱，特别是繁殖分子机理的研究尚缺。本研究对不同发育时期的凡纳滨对虾雌雄性腺组织进行转录组测序和分析，鉴定性别差异表达的功能基因。通过雄性亲虾精巢(Testis)、剪眼柄前雌性亲虾卵巢(Ovary)及剪眼柄后1天（1Day afer Eyestalk Ablation Ovary，1DaEAO）、6天(6Days afer Eyestalk Ablation Ovary，6DaEAO)的雌性亲虾卵巢等4个样品的转录组测序，共获得原始序列249，107，536条，经质量控制、过滤和de novo组装后，获得凡纳滨对虾性腺表达Unigenes65，218个，平均长度1，021bp，N50达到2，000bp。注释到NR，NT，Swiss-Prot，KEGG，COG，GO库的Unigenes数量和比例分别是26，482个(87.39％)，14，626个(48.26％)，23，062个(76.10％)，20，659个(68.17％)，11，935个(39.38％)，12，320个(40.65％)。对GO数据库注释的12，320个Unigenes进行了GO分类，其中分属于分子功能、细胞组分和生物过程的Unigenes数分别为9，884个、19，939个和34，317个。注释到KEGG库的20，659个Unigenes映射到258个代谢通路上，定位基因最多的三个通路分别为代谢、RNA转运和微丝骨架的调控。对卵巢(Ovary)和精巢(Testis)中的基因表达情况进行比较，发现22，808个Unigenes呈现了性别特异性或差异性表达。其中3，529个在卵巢中上调表达，另外19，279个在精巢中上调表达。经过富集分析，得到414个精巢上调表达DEGs(differentially expressed genes)富集的GO terms和646个卵巢上调表达DEGs富集的GO terms，以及34个性别差异基因富集的代谢途径。通过实时定量PCR验证，我们鉴定获得9个卵巢特异表达，6个精巢特异表达、45个精巢上调表达和39个卵巢上调表达的Unigenes。另外，在10，411个Unigenes序列中找到13，223个SSRs，其中2，192个Unigenes包含多个SSR位点。本研究充实了凡纳滨对虾分子遗传信息数据库，并为其繁殖性状的分子调控机理解析与应用建立了基础，挖掘的SSR标记可用于功能基因组研究和分子育种新技术的研发。

目录

声明

摘要

缩略语

1 前言

1．1 凡纳滨对虾

1．2 转录组测序简介

1．3 转录组测序在对虾生物学研究中的应用

1．4 性别相关基因

1．4．1 性别决定基因

1．4．2 性腺分化和性腺发育相关基因

1．5 本研究的目的和意义

1．6 本研究的技术路线

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 凡纳滨对虾亲虾

2．1．2 主要仪器设备

2．1．3 主要试剂盒和试剂

2．1．4 相关溶液的配制方法

2．1．5 器具及处理

2．2 实验方法

2．2．2 总RNA抽提

2．2．3 总RNA完整性和纯度检验

2．2．5 Illumina Hiseq2000平台测序

2．2．6 De novo组装

2．2．7 注释

2．2．8 性别特异表达和差异表达基因的鉴定

2．2．9 半定量和实时荧光定量PCR验证

2．2．1 0 SSR

3 结果与分析

3．1 RNA质检结果

3．2 测序产量

3．3 序列分析与组装

3．4 转录组的完整度

3．5 注释

3．5．1 NR注释

3．5．2 COG注释

3．5．3 GO功能注释

3．5．4 代谢通路分析

3．6 性别差异基因鉴定和富集分析

3．7 性别差异基因的实时荧光定量PCR验证

3．8 SSRs

4 讨论

4．1 性别决定基因

4．2 性腺分化和性腺发育相关基因

4．2．1 性腺组织的体细胞和生殖细胞形成

4．2．2 生殖细胞的RNA翻译调控

4．2．3 性腺差异表达基因

4．3 性别偏向表达基因的验证

4．4 SSR标记的鉴定

5 结论

参考文献

附录

致谢

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