葛根淀粉积累的生理及分子基础研究

摘要

葛根为药食两用植物，富含淀粉和黄酮类物质，具有极大的药用和食用价值。本研究以课题组选育的桂葛1号（广西产区主栽品种）和高产、高粉加工型桂葛8号为材料，研究不同发育时期葛根的农艺性状、叶片光合参数、淀粉积累、淀粉合成途径关键酶活性变化动态;克隆葛根淀粉合成关键酶(AGPase)小亚基基因(sAGP)和大亚基基因(LAGP);利用实时荧光定量PCR技术对大、小亚基基因进行时空表达分析;利用SPSS统计学软件分析葛根不同生长发育时期叶光合特性参数、农艺性状、淀粉积累、淀粉合成酶活性、块根AGPase基因表达量的相关性。获得以下结果:
　　1、葛根发育过程中农艺性状动态变化。整个生长时期，两个葛根品种块根的单株鲜重、产量、干物质含量、平均根长的变化均表现为8号高于1号，并在11～12月份达到显著差异水平，最高值分别是1号的1.9倍、1.9倍、1.58倍、1.19倍。两个葛根品种块根的单株鲜重、产量和干物质含量均表现为6～8月份缓慢增加，9～12月份快速增加。块根的平均根长在6～7月份快速增加，8～12月份缓慢增加，11月份达到最大值后趋于稳定。块根的平均根粗变化趋势基本一致，6～8月份缓慢增加，9～11月份快速增加，11月份达到最大值后趋于稳定，除6～7月份平均根粗为8号略大于1号外，其余月份均表现为1号大于8号，两品种块根的平均根粗10～12月份达到显著差异水平。
　　2、葛根叶片光合特性参数动态变化。在整个生长时期，葛根叶片净光合速率与气孔导度、胞间CO2浓度及蒸腾速率均呈单峰曲线变化，均在10月份达到峰值，之后迅速下降，总体上均表现为8号大于1号，最高值分别是1号的1.28倍、1.23倍、1.01倍、1.17倍。1号的净光合速率在6～8月份缓慢上升，8月份之后迅速提高，而8号的净光合速率在6月份后便迅速提高，10月份后，两品种的净光合速率均逐渐下降，除6月份差异不显著外，其余月份均差异显著。1号的气孔导度在6～7月份缓慢增加，8～9月份逐渐增加，8号的气孔导度在7～9月份逐渐提高，两品种气孔导度在9～10月份均迅速提高，10～12月份均迅速下降，除6月份和7月份两品种差异不显著外，其余月份均差异显著。1号和8号胞间CO2浓度在6～7月份缓慢增加，1号在8月份略有下降，8号在8月份逐渐增加，之后两品种在9～10月份均迅速提高，10～12月份均迅速下降，除6月份、7月份和10月份两品种差异不显著，其余月份均差异显著。两品种蒸腾速率在6～9月份维持在一定水平起伏，9～10月份急速上升，11～12月份急速下降，除10～11月份两品种差异显著外，其余月份均差异不显著。
　　3、葛根发育过程中块根淀粉积累与淀粉合成关键酶活性动态变化。
　　在整个生长时期，两个葛根品种块根的直链淀粉含量、支链淀粉含量和总淀粉含量都是逐渐增加的，6～10月份快速积累，10月份达到最高值后趋于稳定;在各个时期，直链淀粉含量均为1号高于8号，最高值是8号品种的1.19倍;支链淀粉含量与总淀粉含量均为8号高于1号，最高值分别是1号品种的1.21倍、1.08倍。两品种的直链淀粉和支链淀粉含量均为6月份差异不显著，7～12月份均差异显著;总淀粉含量6～7月份差异不显著，8～12月份差异显著。
　　淀粉合成关键酶AGPase、SSS、GBSS、SBE活性在整个生长时期均呈单峰曲线变化，均在10月份达到峰值，总体上均表现为8号高于1号，最高值分别是1号品种的1.31倍、1.35倍、1.29倍、1.1倍。两品种AGPase活性在6月份和12月份差异不显著，7～11月份差异显著。两品种SSS活性在9～10月份差异显著，其余月份差异不显著。两品种GBSS活性在6～8月份差异不显著，9～12月份差异显著。两品种SBE活性在6月份差异不显著，7～12月份差异显著。
　　4、葛根淀粉合成关键酶AGPase大、小亚基基因的克隆。利用PCR同源克隆技术克隆到葛根AGPase小亚基sAGP基因cDNA片段1679bp，编码463个氨基酸，与菜豆、豌豆、鹰嘴豆、小扁豆的sAGP基因核苷酸序列同源性高达90％以上，氨基酸序列同源性高达94％以上，具有很高的保守性。葛根sAGP与菜豆PvAGPS1氨基酸序列同源性高达96％，且聚类分析进化树中两者聚为一类，亲缘关系最近;克隆到葛根AGPase大亚基LAGP基因cDNA片段1273bp，编码307个氨基酸，与菜豆、豌豆等的LAGP基因核苷酸序列同源性为77％～93％，氨基酸序列同源性为69％～88％，其中与菜豆该基因的同源性最高，核苷酸序列高达93％，氨基酸同源性高达88％。
　　5、葛根发育过程中AGPase大、小亚基基因的时空表达动态。
　　两品种块根和根蔸中sAGP基因和LAGP基因表达在6～9月份表达水平均较低，10～12月份表达水平均较高，块根中均差异显著。整个生长发育时期块根中总体表现为8号高于1号。两品种块根sAGP基因表达均呈双峰变化趋势，1号的峰值出现在8月份和10月份，8号的峰值出现在7月份和10月份，除6月份两品种差异不显著外，其余月份均差异显著。1号块根LA GP基因为6～8月份逐渐下降，9～12月份逐渐升高，8号的表达为单峰变化趋势。在根蔸中，两个品种sAGP基因和LAGP基因的表达规律大体相同，即两基因均表现为6月份和10月份时1号略高于8号，差异不显著;9月份时8号略高于1号，差异不显著;8月份和12月份时1号显著高于8号;仅在7月份和11月份差异性变化不同，两品种sAGP基因表达量差异显著，LAGP基因表达量差异不显著，7月份时8号略高于1号，11月份为1号高于8号。在茎中，两个品种sAGP基因和LAGP基因的差异表达变化规律大体一致，即两个葛根品种sAGP基因和LAGP基因表达总体上表现为9～10月份均处于极低水平，其余月份表达水平均较高，除6月份外，两基因表达7～8月份均为1号高于8号，9～12月份表现为8号高于1号，7、8、11和12月份两品种差异达到显著水平，其余月份为差异不显著。在叶中，两个品种sAGP基因表达总体上为6～9月份处于较高水平，10～12月份处于较低水平，两个品种LAGP基因表现为6～10月份处于较低水平，11～12月份处于较高水平。两个品种sAGP基因和LAGP基因的差异表达变化规律大体一致，即除6月份和7月份外，8～9月份均为1号显著高于8号，10～11月份均为8号略高于1号，但差异不显著。
　　两个品种sAGP基因和LAGP基因各时期均存在组织特异性，且在10月份块根中表达量达到最大值时，两基因的表达量均表现为:块根＞根蔸＞茎＞叶片。1号sAGP基因在6～9月份总体上为茎和叶片中表达较高，10～12月份为块根和根蔸中表达较高，8号整个发育时期总体上均为块根中表达水平较高。两个品种LAGP基因在6～9月份，不同部位表达总体较低，在10～12月份，不同部位表达总体较高。
　　6、相关性分析。
　　两个品种葛根叶片的净光合速率与气孔导度、胞间CO2浓度呈极显著正相关，与蒸腾速率呈显著正相关。叶片的净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度与块根支链淀粉、总淀粉含量呈极显著、显著正相关，与直链淀粉含量、单株鲜重、产量、干物质含量和根粗呈正相关，但差异均不显著，且系数值相对较小。单株鲜重、产量和干物质含量与块根支链淀粉、总淀粉含量呈极显著正相关。
　　葛根直链淀粉含量与SSS活性变化呈极显著正相关，与AGPase活性、GBSS活性、SBE活性、块根sAGP基因和LAGP基因表达量均呈显著正相关;支链淀粉含量和总淀粉含量与上述4个淀粉合成关键酶活性、块根sAGP基因和LAGP基因表达量均呈极显著正相关。块根sAGP基因表达量与AGPase活性、SSS活性、GBSS活性、SBE活性均呈极显著正相关;块根LAGP基因表达量与SSS活性、GBSS活性变化呈显著正相关，与AGPase活性、SBE活性呈正相关，但差异不显著。
　　单株鲜重、产量、干物质含量与块根LAGP基因表达量呈极显著正相关;根长与SBE活性呈极显著正相关，与AGPase活性、SSS活性、GBSS活性、块根sAGP基因表达量、块根LAGP基因表达量呈显著正相关。叶净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度与AGPase活性、SSS活性、GBSS活性、SBE活性、块根sAGP基因表达量呈极显著正相关;胞间CO2浓度与块根LAGP基因表达量呈显著正相关;蒸腾速率与AGPase活性、SSS活性、GBSS活性呈极显著正相关，与SBE活性呈显著正相关，与块根AGPase基因表达量均呈正相关，但差异不显著。

目录

声明

摘要

英文缩写表

1．1 葛根的药用价值和食用价值

1．2 葛根的主要成分研究

1．3 葛根种质资源品质的研究

1．4 植物淀粉生物合成研究进展

1．4．1 植物淀粉生物合成途径

1．4．2 淀粉合成途径的关键酶

1．4．3 影响淀粉合成的相关因子

1．5 淀粉合成关键酶AGPase基因克隆和表达研究进展

1．5．1 AGPase基因的克隆

1．5．2 AGPase基因的表达调控研究

1．5．3 AGPase基因的功能研究

1．6 本研究的目的意义

2．1 材料

2．2 实验方法

2．2．1 取材方法

2．2．2 农艺性状的测定

2．2．3 光合特性的测定

2．2．4 直、支链淀粉含量测定

2．2．5 淀粉代谢关键酶活性测定

2．2．6 葛根AGPase基因的克隆

2．2．7 葛根AGPase基因表达分析

2．3 数据分析

3 结果与分析

3．1 葛根发育过程中块根农艺性状的变化

3．1．1 葛根发育过程中块根单株鲜重、产量及干物质含量的变化

3．1．2 葛根发育过程中块根根长的变化

3．1．3 葛根发育过程中块根根粗的变化

3．2 葛根发育过程中叶片光合参数动态变化

3．2．1 葛根发育过程中叶片的净光合速率(Pn)动态变化

3．2．2 葛根发育过程中叶片的气孔导度(Gs)动态变化

3．2．3 葛根发育过程中叶片的胞问CO2浓度(Ci)动态变化

3．2．4 葛根发育过程中叶片的蒸腾速率(Tr)动态变化

3．3 葛根发育过程中块根直链淀粉、支链淀粉及总淀粉含量的变化

3．4 葛根发育过程中淀粉合成关键酶活性的变化

3．4．1 葛根发育过程中AGPase活性变化

3．4．2 葛根发育过程中SSS活性变化

3．4．3 葛根发育过程中GBSS活性变化

3．4．4 葛根发育过程中SBE活性变化

3．5 葛根AGPase基因的克隆

3．5．1 RNA的提取及检测

3．5．2 葛根sAGP基因片段克隆与序列分析

3．5．3 葛根LAG['基因片段克隆与序列分析

3．6 葛根发育过程中AGPase基因的表达分析

3．6．1 葛根发育过程中sAGP基因和LAGP基因在块根中的表达

3．6．2 葛根发育过程中sAGP基因和LAGP基因在根蔸中的表达

3．6．3 葛根发育过程中sAGP基因和LAGP基因在茎中的表达

3．6．4 葛根发育过程中sAGP基因和LAGP基因在叶中的表达

3．6．5 葛根发育过程中sAGP基因在两品种不同部位中的表达

3．6．6 葛根发育过程中LAGP基因在两品种不同部位中的表达

3．7 相关性分析

4 讨论

4．1 葛根光合参数指标间的关系分析

4．2 葛根光合参数、农艺性状指标与淀粉积累的关系

4．3 葛块根淀粉合成关键酶活性、块根AGPase基因表达与淀粉积累的关系

4．4 葛根农艺性状、光合参数指标与块根淀粉合成关键酶活性、块根AGPase基因表达的关系

5 结论

6 本研究创新点

7 问题与展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间科研、学术活动、论文发表情况