基于唾液蛋白组学开发鉴定水牛发情方法的研究

摘要

发情鉴定的准确性是影响水牛的繁殖性能的重要因素。生产中大约有50％左右的水牛发情现象不能被准确监测，导致错过了最佳配种时间，造成经济损失。因此，筛选一种简单可行的鉴定水牛发情的方法，对水牛生产和繁育具有重要意义。本研究以非侵入性的体液（唾液）作为试验材料，对成年母水牛整个发情周期的血液和唾液激素变化，发情期唾液结晶变化与卵巢卵泡发育进行关联分析;以蛋白定量技术(iTRAQ，isobaric tags for relative and absolute quantitation)分析了不同发情期的差异蛋白并进行验证。主要研究结果如下: 1.水牛唾液和血液发情周期生殖激素的变化规律。本研究采用酶联免疫分析方法(ELISA)分别对水牛整个发情周期的唾液和血液的生殖激素水平变化规律进行测定:水牛血液和唾液中的E2和P4呈波动性变化，发情前期，唾液中P4浓度一直维持在6.5～7.1ng/mL，第13天达到峰值，随后快速下降。唾液中E2浓度在发情前期第3～5天出现一个峰值，在14～17d唾液中E2浓度显著升高，出现第二个峰值。唾液E2和P4浓度的变化趋势和血清E2和P4浓度的变化趋势基本一致。母水牛唾液E2和P4浓度相关性极显著相关(R=0.7754，P＜0.01)，母水牛唾液和血清标本的FSH浓度相关性显著(R=0.3471，P＜0.05)。 2.发情周期唾液结晶几何结构分析。水牛发情周期唾液表现为蕨类植物形态，树枝样形态，松针样形态，圆点型，树枝型-蕨类植物结合型等多种形态;发情当天可见典型的蕨类植物形态和树枝样形态。经B超同步检测卵巢上卵泡的发育情况发现，典型的唾液结晶形态与发情当天卵巢上优势卵泡的发育相一致，且唾液结晶的分形几何分析得出，发情当天分形维值最低。 3.水牛唾液生殖激素、唾液结晶和卵泡变化进行关联分析。水牛发情当天唾液雌激素的水平为240.16±32.92pg/mL，达到一个峰值，随后开始缓慢的降低。水牛唾液中孕激素水平在发情前48小时达到了16.50±5.82ng/mL，发情当天降低到8.95±7.50ng/mL。水牛发情阶段LH在发情前24小时逐渐下降，激素水平从6.05±0.81ng/mL到3.95±2.06ng/mL;但在发情后12小时后逐渐升高，达到6.22±1.68ng/mL。FSH激素水平基本比较平稳，变化不大。B超监测卵巢卵泡卵泡从发情前2天迅速生长，到发情当天达到20mm左右，卵泡的大小直到破裂排卵变化不显著。排卵后形成的黄体，黄体期一直维持到下次发情前四天左右，期间在发情后14～17天黄体的最大，与前面得出的水牛唾液中促黄体激素分泌峰一致。并对并对唾液结晶方法、直肠检查法、唾液结晶+B超、直肠检查+B超四种方法进行了生产中的验证，得出唾液结晶+B超的发情率最高，妊娠率比其他组高，但差异不显著。 4.选取发情周期水牛的唾液作为试验材料，采用iTRAQ蛋白质组定量技术鉴定水牛发情周期的差异蛋白表达。共鉴定1160个蛋白质，VENN图对发情周期的不同阶段的组别（间情期:发情前期;间情期:发情期;间情期:发情后期;间情期:发情前期+发情期+发情后期）进行分析发现，这四个组有105个共有蛋白，发情期与间情期组有87特有差异蛋白。所有鉴定到的蛋白分别参与到了7个代谢通路中，参与蛋白数量最多的通路是唾液分泌，应用生物学信息分析软件进行了差异蛋白的网络互作分析。发情期与间情期组的差异蛋白质之间的互作关系网络图分析发现共有297个点，形成的两两互作关系有1272个，显示最高的基因是“ENO1”。 5.采用免疫印迹法对水牛发情周期筛选的差异蛋白SERPRINA1、ANNEXIN、HSP-70、ENDOU进行了验证。验证的蛋白中SERPRINA1、ANNEXIN、HSP-70蛋白在发情期唾液中的表达量的比间情期、发情前期和发情后期这三个发情阶段的变化明显提高。ENDOU(PP11)蛋白的表达量在发情前期升高，发情期降低。验证蛋白的变化趋势和蛋白组学研究结果相一致。不同水牛的SERPRINA1、ANNEXIN、HSP-70三个蛋白验证结果与上述结果也一致，ANNEXIN、HSP-70可能作为后续试剂盒开发的候选蛋白用于后续的研究。

目录

声明

摘要

第一章文献综述

1水牛的繁殖特性

1．1水牛的发情周期

1．2水牛的发情特点

1．3水牛发情周期生殖激素变化规律的研究

1．4非损伤性的方法应用于动物激素水平的研究

2唾液的性状

2．1唾液激素测定研究与应用

2．2睡液与血浆性激素浓度的关系

2．3唾液生殖激素浓度变化的影响因素

2．4唾液结晶与动物发情排卵的关系

2．5水牛体液激素测定的研究进展

3蛋白质组学

3．1蛋白质组学概述

3．2蛋白质组学研究技术

3．3唾液蛋白组学研究

4水牛唾液蛋白组学研究

5研究的目的意义

第二章水牛发情周期唾液和血液生殖激素变化规律的研究

1材料与方法

1．1试验牛的选择

1．2试验牛的发情鉴定

1．3样品的收集

1．4血清的制备与保存

1．5血清、唾液激素浓度的测定

1．6水牛唾液和血液生殖激素的测定

1．7数据分析

2结果

2．1自然发情水牛血清E2、P4水平在整个发情周期中的变化

2．2自然发情水牛血清FSH、LH水平在整个发情周期中的变化

2．3自然发情水牛唾液和血清FSH、LH、E2、P4水平相关性分析

3讨论

3．1水牛发情周期唾液和血液生殖激素的变化规律分析

3．2水牛发情周期唾液和血液生殖激素相关性分析

4结论

第三章水牛唾液结晶几何结构研究

1试验材料

1．1试验动物

1．2试验方法

1．3．唾液结晶的分析

2结果

2．1母水牛发情周期不同阶段唾液结晶形状的判定

2．2母水牛发情周期唾液结晶与卵巢卵泡发育的关系

2．3母水牛发情周期唾液结晶分形几何分析

3讨论

3．1水牛唾液结晶与其发情的关系分析

3．2水牛唾液结晶分维值的分析

4结论

第四章水牛发情期唾液生殖激素、唾液结晶和卵泡变化的关联分析

1材料与方法

1．1试验牛的选择

1．2试验牛的发情鉴定

1．3样品的收集

1．4血清的制备与保存

1．5血清、唾液激素浓度的测定

1．6唾液结晶制作

1．7统计分析

2结果与分析

2．1水牛发情期唾液生殖激素变化

2．2水牛发情期卵巢卵泡发育变化

2．3水牛发情期唾液结晶的变化

2．4水牛唾液发情鉴定的方法验证

3讨论

3．1水牛发情期激素水平变化规律分析

3．2水牛唾液结晶与激素相关性分析

3．3水牛发情鉴定方法的生产中验证

4结论

第五章水牛发情周期唾液蛋白质ITRAQ鉴定及生物信息学分析

1．1试验材料

1．2主要仪器及试剂

2试验方法

2．1蛋白质提取

2．2蛋白质Bradford定量

2．3聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和检测蛋白质

2．4丙酮沉淀蛋白质

2．5蛋白质的封闭，还原及酶解

2．6 ITRAQ标记样品

2．7合并标记好的样品

2．8脱盐

2．9酶切

2．10质谱检测

3水牛唾液差异蛋白的统计

4 GO功能注释

5 COG注释

6水牛唾液蛋白KEGG pathway代谢通路分析

7．1 Bradford定量标准曲线绘制

7．2唾液样品蛋白的测定

7．3水牛唾液蛋白质的鉴定

7．4鉴定和差异蛋白质的功能注释

7．5蛋白定量统计结果

7．6鉴定水牛唾液蛋白的GO功能注释

7．7差异蛋白的GO富集分析

7．8水牛唾液蛋白的COG注释

7．9水牛唾液蛋白的pathway代谢通路注释

7．10差异蛋白的注释

7．11差异富集蛋白VENN分析

7．12差异蛋白的KEGG pathway富集分析

7．13相互作用蛋白质组预测

8讨论

8．1水牛唾液样品的采集对蛋白组学研究的影响

8．2水牛唾液样品的同位素标记相对和绝对定量技术鉴定

8．3水牛唾液ITRAQ方法不足分析

8．4水牛唾液差异蛋白的研究

8．5蛋白质互作网络分析

9结论

第六章水牛唾液发情周期特异蛋白的筛选及验证

1材料与方法

1．1主要试剂和材料

1．2主要仪器及耗材

1．3主要溶液的配置

2实验方法

2．1唾液蛋白的提取及定量

2．2 SDS-PAGE

2．3统计分析

3结果

3．1水牛发情周期蛋白含量的测定

3．2水牛发情周期唾液蛋白含量和PH变化的关系

3．3水牛发情阶段唾液蛋白质含量和PH浓度的关系

3．4水牛发情周期唾液差异蛋白的表达

3．5水牛发情阶段唾液差异蛋白的表达

4讨论

5小结

结论

创新点及下一步工作计划

参考文献

缩略词

附录

攻读学位期间发表论文情况

致谢