人脐带血间充质干细胞分离培养及诱导表达IDO对免疫介导再生障碍性贫血小鼠的治疗研究

摘要

第一部分人脐血间充质干细胞的分离培养及其生物学特性研究
　　目的：从人的脐带血中分离和培养脐带血间充质干细胞（umbilical cord blood-mesenchymal stem cells, UCB-MSCs），探讨其培养条件、表面标志表达以及体外多向分化潜能等生物学特性。
　　方法：1.建立分离培养方法：淋巴细胞分离法与羟乙基淀粉沉降+淋巴细胞分离两步法进行比较；2.细胞生长及增殖能力观察；3.免疫表型测定；4.诱导多向分化潜能：选取P3~P5 UCB-MSCs，经成骨、成脂诱导分化，分别用茜素红、油红O染色鉴定。
　　结果：通过羟乙基淀粉沉降+淋巴细胞分离两步法分离得到的脐带血单个核细胞数量较淋巴细胞分离法明显增多，UCB-MSCs为成纤维样细胞贴壁生长，原代培养3-4周呈现平行或漩涡样生长；流式细胞术检测结果表明，UCB-MSCs表达黏附分子CD44表面标志及干细胞特征标志CD73，不表达造血分子 CD34，具有MSCs特征；体外诱导成骨、脂肪细胞分化成功，表明其具有分化潜能。
　　结论：UCB-MSCs在体外成功分离与培养，具有间充质干细胞生物学特性。
　　第二部分 IFN-γ诱导脐血间充质干细胞IDO表达及对异基因淋巴细胞增殖的影响
　　目的：探讨不同浓度的γ-干扰素（IFN-γ）作用于UCB-MSCs，诱导其表达吲哚胺2，3-双加氧酶（IDO）的情况；观察UCB-MSCs上的IDO表达对异基因淋巴细胞增殖的影响。
　　方法：选取P3~P5 UCB-MSCs，经不同浓度IFN-γ(0、50、100、200、400 U/ml)诱导刺激24h，提取细胞mRNA和蛋白，分别采用RT-PCR法和Western blot检测IDO表达情况。在有/无 IDO特异性抑制剂1-甲基色氨酸（1-MT）的情况下，设定 UCB-MSCs不同浓度组，丝裂霉素 C处理，与异基因淋巴细胞共培养，MTT法检测淋巴细胞增殖率。
　　结果：UCB-MSCs本身不具有IDO的表达，经 IFN-γ刺激作用下出现 IDO mRNA、IDO蛋白表达，且表达量与 IFN-γ的刺激浓度呈剂量依赖关系。UCB-MSCs：淋巴细胞比值为1：1，1：10，1：50时，与对照组比较，淋巴细胞增殖率均显著降低（P<0.05），且随UCB-MSCs浓度减小，对淋巴细胞增殖的抑制率减低。当UCB-MSCs：淋巴细胞比值为1：100时，淋巴细胞增殖率与对照组相比无明显差别（P>0.05）。在加入1-甲基色氨酸（1-MT）的共培养体系中， UCB-MSCs对T细胞增殖的抑制作用恢复。
　　结论：UCB-MSCs在IFN-γ的诱导作用下可表达IDO，对异基因淋巴细胞的增殖可能发挥免疫抑制作用。
　　第三部分人脐血间充质干细胞的IDO表达对免疫介导再生障碍性贫血小鼠治疗作用的研究
　　目的：建立免疫介导再障小鼠模型，探讨人脐带血间充质干细胞的IDO表达对再障小鼠的治疗影响及其发挥免疫抑制作用的机制。
　　方法：采用SPF级6～14周龄雌性DBA/2小鼠为供鼠，经5.5Gy60Co-γ射线全身照射的8～12周龄雌性BALB/C小鼠为受鼠，移植供鼠胸腺/淋巴结细胞，建立免疫介导再障模型；建模稳定后，经小鼠尾静脉输注UCB-MSCs（1×103/g），观察各组小鼠外周血象、骨髓病理形态以及造血负调控因子INF-γ水平的变化。
　　结果：再障模型建立后7~16d，AA小鼠出现皮毛散乱、食欲下降，体重减轻22.58±15.74％，苍白萎顿；第14d模型组外周血象、骨髓造血明显降低，经尾静脉输注MSCs进行观察，2周时血象指标回升，与模型组相比差异显著。MSCs的IDO的表达对再障小鼠各血象指标的变化效果明显，同时骨髓造血情况也有明显改善。
　　结论：具有表达IDO的UCB-MSCs输注再生障碍性贫血小鼠模型，可减轻小鼠骨髓造血衰竭程度。

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中文摘要

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前言

第一部分 人脐血间充质干细胞的分离培养及其生物学特性研究

引言

主要材料与仪器

实验方法

实验结果

讨论

参考文献

第二部分 IFN-γ诱导人脐血间充质干细胞IDO表达及对异基因淋巴细胞增殖的影响

引言

主要材料与仪器

实验方法

实验结果

讨论

参考文献

第三部分 人脐血间充质干细胞的IDO表达对免疫介导再生障碍性贫血小鼠治疗作用的研究

引言

主要材料与仪器

实验方法

实验结果

讨论

展望

参考文献

结论

致谢

附录 A主要英文缩略词

附录 B常用试剂配制

附录 C个人简历及发表文章

附录D 综述：IDO与再生障碍性贫血的免疫介导