康宁木霉纤维素酶发酵条件和CBH2基因表达研究

摘要

纤维素酶降解途径是自然界中各类纤维素降解的最主要方法，而木霉是目前发现的产纤维素酶能力最强的微生物，自然界丰富的纤维素资源的降解和利用依赖于木霉类真菌。因此系统的研究木霉产纤维素酶的条件以及所产纤维素酶的酶学性质是很有必要的，研究纤维素酶高产菌株康宁木霉(Trichoderma koningii)AS3.2774 产纤维素的条件及酶学性质是本实验的一个方面；另外，本实验利用生物信息的手段对康宁木酶CBHⅡ基因翻译和表达成蛋白质的调控机理进行研究；本实验还将纤维素酶CBHⅡ基因的cDNA转化大肠杆菌BL21(DE3)表达并纯化得到纤维二糖水解酶。 研究康宁木霉AS3.2774产纤维素酶的最适发酵条件，包括固态发酵和液态发酵中各种影响产纤维素酶的因素，对各单因素进行了优化，找到了最佳发酵产酶配比。通过对康宁木霉AS3.2774所产纤维素酶酶学性质的研究，得到了该酶最适宜的作用环境。 康宁木霉纤维素酶为诱导酶，当培养体系中纤维素的存在可以激发纤维素酶的产生，当体系中有葡萄糖时，纤维素酶系基因的转录和表达受到抑制。这一点从前面的酶学性质研究中也可以看出。本实验利用SignalP 软件分析，预测并分析该酶蛋白的信号肽，为研究CBH Ⅱ基因的翻译和表达调控机理打下了基础。 最后依据刘昌雄克隆的木霉CBHⅡ基因cDNA序列，重新构建PET-28a(+)原核表达载体，转化大肠杆菌，并在大肠杆菌BL21(DE3)中以IPTG诱导表达，以镍离子螯合型琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化，获得了纯化的纤维二糖水解酶蛋白。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第一章前言

1.1课题的目的和意义

1.2纤维素酶概述

1.2.1纤维素的特性

1.2.2能降解纤维素酶的微生物群落

1.2.3纤维素酶酶系的组成及理化性质

1.2.4纤维素酶分子生物学

1.3国内外的研究进展

1.4纤维素酶的应用

1.4.1纤维素酶在饲料中的应用

1.4.2纤维素酶在造纸工业中的应用

1.4.3纤维素酶在食品工业中的应用

1.4.4纤维素酶在纺织工业中的应用

1.4.5纤维素酶在洗涤剂工业应用

1.4.6纤维素酶对烟草品质的改良

第二章材料与方法

2.1材料及培养基、溶液的配制

2.1.1试剂、仪器和原料

2.1.2供试菌种

2.1.3培养基及培养条件

2.1.4溶液的配制

2.2试验方法

2.2.1康宁木霉降解纤维素的研究

2.2.2康宁木霉CBHⅡ基因的表达与纯化

2.2.3康宁木霉CBHⅡ基因的生物信息学分析

第三章结果与分析

3.1康宁木霉培养条件和纤维素酶酶学性质研究结果

3.1.1固体培养条件的优化

3.1.2液体培养条件的优化

3.1.3影响纤维素酶酶活的因素

3.1.4纤维素酶对不同类型废纸的降解

3.2CBHⅡ基因的表达与纯化

3.2.1碱裂解法小量提取质粒法和试剂盒提取质粒电泳结果

3.2.2PCR扩增琼脂糖凝胶电泳检测结果

3.2.3 Pet-28a和cDNA双酶切电泳检测结果

3.2.4重组Pet-28a质粒的鉴定结果

3.2.5康宁木霉CBHⅡ基因的表达

3.2.6重组CBHⅡ蛋白的纯化

3.2.7纤维二糖水解酶酶活的测定

3.3康宁木霉CBHⅡ基因的生物信息学分析结果

3.3.1 CBHⅡ基因结构特征分析

3.3.2 CBHⅡ基因编码蛋白结构特征分析

3.3.3 CBHⅡ基因编码蛋白信号肽分析

第四章结论与讨论

4.1结论

4.2讨论

4.2.1康宁木霉发酵产纤维素酶和纤维素酶活测定中遇到的问题

4.2.2表达与纯化中的问题

参考文献

附表

致谢

个人简历