前列腺特异膜抗原基因的克隆与表达

摘要

【背景】该实验获得了有效的肿瘤抗原靶基因,为研究基因转染的DCs疫苗提供了必需的条件.【目的】构建PSMA真核表达系统,为基因修饰的前列腺癌DC s疫苗提供物质基础.【方法】从前列腺癌组织中提取总RNA,反转录为c DNA.根据Ge nebank上的PSMA序列(M99487)设计一对含BamHl和Xhol酶切位点的引物,PCR扩增cDNA.PCR产物和真核表达载体pcDNA3分别经双酶切后凝胶回收纯化,用T4连接酶连接,转化用氯化钙法制备的感受态大肠杆菌DH5 α.从氨苄青霉素阳性的LB转化平板上随机挑取单菌落,增菌并提取质粒,进行PCR鉴定和酶切鉴定,含有目的片断的为阳性重组子,采用自动序列分析仪对PSMA-pcDNA3插入片段进行序列测定.采用无菌操作提取并纯化PSMA-pcDNA3质粒,用脂质体转染法转染人前列腺癌细胞系PC-3,转染后24小时用G418 300μg/ml选择培养基培养,对G418抗性克隆用RT-PCR方法筛选鉴定阳性克隆,扩大培养阳性克隆,获得稳定生长并表达PSMA目的蛋白的阳性克隆细胞株,200 μ g/ml维持筛选.用间接免疫荧光法检测转染表达PSMA蛋白在细胞中的位置.提取细胞总蛋白,用Western Blotting法鉴定转染细胞表达PSMA蛋白的分子量.【结论】1.利用RT-PCR技术成功扩增了PSMA编码区cDNA,经序列分析显示扩增片断的序列正确.2.构建了PSMA真核表达载体,建立了稳定表达PSMA的细胞株.3.经免疫分析,证实了真核细胞内表达的PSMA为分子量正确的膜蛋白,且具有良好的抗原性.4.所获得的PSMA真核表达系统为基因修饰的DCs疫苗治疗前列腺癌提供了物质基础.

目录

文摘

英文文摘

前 言

第一部分 前列腺特异膜抗原真核表达载体pcDNA3.0-PSMA的构建及序列测定

引言

材料与方法

结 果

讨 论

第二部分pcNAA3.0-PSMA在PC-3细胞中的表达及产物鉴定

引言

材料和方法

结 果

讨 论

结 论

参考文献

附 图

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